蝮蛇蛇毒中提取的一种具有激肽原酶活性的蛋白水解酶

1、蝮蛇蛇毒中提取的一种具有激肽原酶活性的卵白水解酶摘要】目的:从蛇毒中得到大量高纯度的具有激肽原酶活性的卵白水解酶。要领:接纳离子互换和亲和层析技能举行纯化。效果:从江浙蝮蛇毒中提取出了一种高纯度的具有激肽原酶活性的卵白水解酶,不需活化即可水解激肽原,开释激肽,并具有精氨酸酯酶活性。粗毒经提纯,比活可达800u/g以上,远远高于哺乳动物泉源的激肽原酶,纯度可达95%以上。对其性子观察,r为38000,n-末了的15个氨基酸序列阐发表白,该酶与蛇毒丝氨酸卵白酶及胰卵白酶激肽开释酶同源。结论:这种要领得当于产业化消费。【关键词】江浙蝮蛇蛇毒激肽原酶自从有人在美洲锋芒蝮蛇(bthrpsjararaa)

2、蛇毒中创造激肽原酶后,蛇毒激肽原酶越来越受到宽大学者的器重1。我国蛇类资源富厚,但受提纯工艺的限定,至今仍未开拓出蛇毒激肽原酶的药物制剂。我们接纳离子互换和亲和层析技能,从江浙蝮蛇agkistrdnhalyspallas蛇毒中提取了高纯度的激肽原酶,并对其性子举行了研究。1质料和要领1.1质料江浙蝮蛇蛇毒冻干粉辽宁省清源县,deae-sepharse,琼脂糖凝胶瑞典pharaia公司,苯甲酰精氨酸乙酯baee,对甲苯磺酰精氨酸甲酯tae,尺度卵白,激肽原,激肽等底物siga公司,低压型高效液相色谱仪日本岛津公司,8823b紫外检测仪北京宾达英创科技,balb/小鼠7周龄由中国药品生物成品检定所

3、实行动物中央提供。1.2要领2效果2.1蛇毒激肽原酶的分散纯化蝮蛇毒经deae-sepharse阴离子互换层析,亲和层析,可将杂质卵白撤除,得到的样品经hpl查验,纯度可达95%以上。图1deae-sepharse离子互换色谱图略透过峰事后,梯度洗脱得到5个峰,经定性检测3,4号峰为活性峰.图2蛇毒激肽原酶亲和色谱图略1:平衡液洗脱透过峰;2:为亲和洗脱液洗脱所得活性峰.图3激肽原酶纯度查验图谱略色谱条件:tsk-2000凝胶柱,280n检测,流速1.0l/in,0.5l/l磷酸盐缓冲液ph7.0为活动相,对峰面积积分,主峰面积达95%以上.图4激肽原酶sds聚丙烯酰胺电泳图谱略:分子量尺度品

4、;s:蛇毒激肽原酶样品.2.2活性测定与粗毒比拟,提纯高的激肽原酶比活进步了约300倍,活力接纳率可达60%以上,水解baee的比活可到达800/g以上,水解tae活性较低,约是水解baee活性的5%。2.3理化性子经sds聚丙烯酰胺电泳及hpl要领检测,江浙蝮蛇毒激肽原酶的r约为38000,与构造型激肽原酶相似。2.4江浙蝮蛇毒激肽原酶与其他蛇毒丝氨酸卵白酶、哺乳动物胰卵白酶n末了氨基酸序列4比力蛇毒激肽原酶与其他它丝氨酸卵白酶具有同源性,属丝氨酸卵白酶的一种,且与哺乳动物的胰卵白酶激肽开释酶具有同源性。表1江浙蝮蛇毒激肽原酶与其他蛇毒丝氨酸卵白酶、哺乳动物胰卵白酶n末了氨基酸序列比力略3讨

5、论激肽原酶在体内有紧张的生理成效5,如今临床普及用于原性高血压、心绞痛、动脉硬化、视网膜血流停滞、肢端知觉非常,闭塞性血栓性血管炎等疾病的治疗。但由于以往从哺乳动物的胰腺提取的胰激肽原酶纯度不高,具有必然的抗原性,进入人体后,大概诱发过敏抗原抗体反响,已有报导注射胰激肽原酶导致结实性药疹6及重症多形红斑药疹7,且不克不及实现静脉给药,使药物不克不及最大限度发挥效用。比年的提取工艺虽可得到高纯度激肽原酶,但在提取历程中,酶活力丧失较大,接纳率低,难以实现产业化消费,因此探求高纯度且无抗原性的激肽原酶并创立一套得当产业范围化消费的工艺要领是如今面对的新课题。我们在传统提取工艺的底子上,用离子互换,

6、亲和层析两步即可制备高纯度的蛇毒激肽原酶,该要领装备简朴,条件暖和,产物接纳率高,产量大,完全切合产业化消费的要求,弥补了蛇毒激肽原酶消费工艺上的一项空缺。与哺乳动物泉源的激肽原酶比拟,从江浙蝮蛇毒中提取的激肽原酶有如下特点:比活高800u/g,r小约为38000,等活力单元给药卵白含量低,不易引起过敏反响;纯度高,提纯后纯度可达95%以上。假设用于药物,大大进步了药物的宁静性;无病毒隐患。不携带大概同人类配合熏染的病毒。无酶原情势,不需活化即可开释激肽,可直接发挥作用。该蛇毒激肽原酶最适ph值为7.08.0,且在ph4.09.0范畴内,活力根本保持稳定,有利于在人血浆情况中保持其活性。该酶在

7、30以下活力根本稳定,而在冻干状态下,37安排90d,活力落落在5%以内,经试验,在整个冻干制剂消费历程中,酶活力的丧失率均在10%以内,因此可以消费出相对稳定的制剂产物。n-末了的氨基酸测序效果表白,蛇毒激肽原酶与其他它丝氨酸卵白酶同源,属丝氨酸卵白酶的一种,大概也具备大多数蛇毒丝氨酸卵白酶的特性具有较长的生理半衰期,大概成为临床用药;同时,它与哺乳动物的胰卵白酶激肽开释酶具有同源性,可以部门说明其与构造激肽原酶的相似性。蛇毒激肽原酶具有一样平常卵白酶的性子,不是金属酶,而zn2+、2+对酶活性的影响的机制大概与改变其构象有关,有待进一步证实。总之,我们从蛇毒提取的激肽原酶将为药学范畴提供一

8、条新的途径,应用于药物必将带到临床新的治疗要领。【参考文献】1yusefg,diaandisep.anverviefthekallikreingenefailiesinhuansandtherspeies:eergingandidatetuurarkersj.linbihe,2022,36(6):443-452.2王心民,戚正武.浙江蝮蛇agkistrdnhalyspallas蛇毒激肽开释酶i的分散纯化及其性子的研究j.生物化学与生物物理学报,1984,161:15-25.3韦传宝,陈建智.蛇毒卵白组分的断定j.中国毒蛇学,1995:370.4angy,angsr,tsaiih.serineprteaseisfrsfdeinagkistrdnautusven:lning,sequeningandphylgenetianalysisj.bihej,2001,(354):161-168.5华慧,周思翔,王正荣.构造激肽开释酶家属、激肽开释酶激肽原激肽体系及其紧张应用j.