动物病原学实验(动药专业)课件

1、动物病原学实验潘子豪进入实验室的注意事项1 穿工作服2 书本等物品放入抽屉3 树立无菌概念4 不能抽烟、吃零食5 爱护公物，注意节约实验一显微镜的构造和使用及细菌形态结构的观察一、目的要求：1、了解显微镜的简单构造原理2、学习掌握油镜的使用技术3、观察细菌的基本形态二、实验材料：普通光学显微镜 、香柏油、二甲苯、擦镜纸、 标本玻片:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌 三、普通光学显微镜的基本结构四、几种显微镜的简单原理 1、暗视野2、相差3、荧光4、电子五、油镜的识别及使用和原理六、使用完毕显微镜及标本片的处理七、作业：1、普通显微镜与油镜使用上有何区别？2、绘出你所观察到的

2、细菌形态。普通光学显微镜的简单原理 分为光学显微镜和电子显微镜。 光学显微镜又分为单式和复式。四、油镜的识别及使用原理1 光圈调最大2 标本上滴加香柏油0.5-1滴3 转换油镜头浸入油滴中五、使用完毕显微镜及标本片的处理油镜用过后，应立即用擦镜纸将镜头和玻片擦拭干净如油渍已干，须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶液拭去油渍，再用干擦镜纸拭净镜头作业1。普通显微镜与油镜使用上有何区别？2。绘出你所观察到的细菌形态枯草杆菌，革兰氏染色枯草杆菌，芽胞简易染色葡萄球菌，革兰氏染色大肠杆菌，革兰氏染色破伤风梭菌，芽胞染色实验二 细菌抹片的制备方法、染色及显微镜观察 实验二细菌抹片的制备方法、染色及显微镜观察 一、

3、目的要求：a) 掌握细菌抹片的制备方法b) 掌握几种常用的染色方法和技术及无菌操作技术c) 巩固显微镜的使用，并了解细菌的染色特性、形态二、 材料：炭疽杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌斜面，大肠杆菌肉汤三、 制片及染色步骤：取干净玻片抹片干燥固定染色干燥镜检四、 常用的几种染色方法1、 革兰氏染色法（1） 草酸铵结晶紫染液1-2分钟，水洗（2） 革兰氏碘液媒染1-3分钟，水洗（3） 95%酒精脱色30秒-1分钟，水洗（4） 沙黄水溶液复染10-30秒，水洗（5） 吸干，镜检2、 姬姆萨染色法（1） 甲醇固定3分钟，时间长短均可（2） 姬姆萨液足量30分钟或数小时至24小时，水洗（3） 吸干，镜检3、

4、瑞氏染色法抹片干燥无需固定，直接滴加染液13分钟，再加等量中性蒸馏水，轻轻混匀，续染15分钟水洗，吸干镜检4、 美兰染色法：甲醇固定3分钟，加上足量染液23分钟，水洗，吸干镜检五、作业：1、 根据实验体会，你认为制备染色标本时应该注意哪些事项？2、 在你所做的革兰氏染色片中，大肠杆菌和炭疽杆菌各染成何色？它们是革兰阳性菌还是革兰阴性菌？3、 作革兰氏染色时，涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败关键一步是什么？一、目的要求1。掌握细菌抹片的制备方法2。掌握几种常用的染色方法和技术及无菌操作技术3。巩固显微镜的使用，了解细菌的染色特性、形态二、材料1、大肠杆菌：斜面、肉汤金黄色葡萄球菌：斜面炭疽杆菌

5、：斜面2、革兰染色液、美兰染色液3、载玻片、接种棒、酒精灯等三、制片及染色步骤取干净玻片-抹片-干燥-固定-染色-干燥镜检 1、玻片的处理：旧玻片有油，用95%酒精擦洗，然后在酒精灯上灼烧 2、细菌抹片的制备：抹片 根据所用材料不同，抹片的方法也有差异。 （1）固体培养物 用经酒精灯火焰烧过的接种环，蘸取生理盐水1-2环于清洁无油脂的载玻片中央，再勾取细菌的固体培养物少许混于生理盐水中，涂抹成直径为1-1.5cm大小的均匀的抹片。 （2）液体培养物 可直接用灭菌接种环勾取细菌培养物1-2环，涂抹于玻片上即可。但要注意将管底沉淀物摇匀，以免影响涂片效果。 （3）组织涂片 用灭菌的剪刀、镊子取被检

6、组织一小块，以其断面在玻片上压印或涂抹成适当大小的薄片。如为脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。 （4）无论何种方法切忌涂片太厚，否则不利于染色和观察。 3、固定 （1）目的:1)、除去抹片上的水分，使菌体蛋白附着在载玻片上，以防染色过程中被水冲掉。2)、使抹片易于着色，变性的蛋白质着色力强。 3)、能杀死抹片中的部分微生物。 （2）方法： 1)、火焰固定 将已干燥的抹片菌膜向上，以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次（以不烫手背为宜）。 2)、化学固定 加数滴甲醇于玻片上，固定2-3分钟，自然四、常用的几种染色方法1、革兰氏染色法2、姬姆萨染色法3、瑞氏染色法4、美兰染色法（一）革兰氏染色法1。

7、草酸铵结晶紫染色1-2，水洗2。革兰氏碘液媒染1-2，水洗3。95%酒精脱色约30-1，水洗4。沙黄水溶液复染10 -30 ，水洗5。吸干，镜检（二）姬姆萨染色法1。甲醇固定3 ，时间长短均可2。姬姆萨液足量30 或数小时至24h，水洗3。吸干镜检（三）瑞氏染色法抹片干燥无需固定，直接滴加染色液 1-3 ，再加等量中性蒸馏水，轻轻混匀，续染15 ，水洗，吸干镜检（四）美兰染色法1。固定好抹片加上足量染液2-3 2。吸干镜检注意事项1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开2、涂片不宜太厚，涂布时宜轻不宜重3、保持无菌操作，试管开塞回塞前，管口消毒4、接种棒使用前后一定要在火焰上彻底灼烧灭菌，挑菌前待接

8、种棒冷却后才用作业1。根据实验体会，你认为制备染色标本时应注意哪些事项？2。在你所做的革兰氏染色片中，大肠杆菌和炭疽杆菌各染成何色？它们是革兰阳性还是阴性菌？3。作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败关键一步是什么？返回实验三、培养基的制备实验三、培养基的制备一、 目的要求：1、 掌握基础培养基制备的原则和要求; 2、 掌握一般培养基的制备过程及PH的测定二、实验材料:（略）三、 操作方法：1、普通肉汤的制备：按量称取加热溶解调PH 过滤分装灭菌菌检分别称取牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl 5g 磷酸氢二钾1g蒸馏水1000ml置铝锅内加热溶解，取5ml肉汤于试管内，用0.1N NaOH

9、校PH至7.4-7.6，并根据其用量计算所配培养基需用的1NNaOH量，调PH，测好PH后，取500ml肉汤至量筒，余下的倒入大烧杯用滤纸过滤，分装10根短试管，余下的装入盐水瓶。2、普通琼脂培养基的制备：称取琼脂肉汤内溶化分装试管灭菌菌检将量筒内的500ml肉汤倒入铝锅，加入10g琼脂条，加热溶解，加热中搅动，用纱布棉花过滤，分装长试管10管，余下装入盐水瓶。以上培养基分装完毕，捆扎好，每组做标记。3、将分装好的培养基扎口后高压灭菌（121，20-30分钟）。4、菌检四、作业：1、 制作培养基时应注意哪几点？为什么高压灭菌前需调PH稍高些？2、 测较少量肉汤培养基的酸碱度至PH7.6时，采用

10、0.1NNaOH溶液，而将全部肉汤培养基调至PH7.6 时，却改用1NNaOH溶液，为什么？3、 普通肉汤与普通琼脂培养基各有什么用途？一目的要求1、掌握基础培养基制备的原则和要求2、掌握一般培养基的制备过程及PH的测定二培养基的种类及用途1、固体培养基：分离培养、纯培养、保存菌种2、半固体培养基：细菌运动3、液体培养基：观察细菌的生长状况、保存菌种三、培养基制作的注意事项1、细菌生长所需的营养物质2、盛器均需无菌，不含抑菌物3、必须符合生长要求PH4、要过滤，应为半透明或透明5、制好后需高压灭菌四、培养基制备的一般过程按量称取溶解调PH过滤分装灭菌菌检五、PH测定方法1、 以空试管取5ml溶

11、解的肉汤，用1ml滴管吸0.1N NaOH，滴定，边滴边测PH，PH7.6时，计量NaOH用量。算出实际用量。2、改用1N NaOH调PH7.6。基础培养基制备1、配方：牛肉膏5克蛋白胨10克NaCL5克磷酸氢二钾1克蒸馏水1000ml2、按量称取溶解调PH过滤分装10根短管灭菌菌检琼脂培养基的制备测好PH后，取500ml肉汤至量筒，余下的倒入大烧杯，把量出的500ml再倒入锅中，称量10g琼脂，边加热边搅动，看一下水位，补足水分。琼脂完全溶解后以棉花沙布过滤，分装10根长管。 返回作业1、制作培养基时应注意哪几点？为什么高压灭菌前需调PH稍高些？2、测较少量肉汤培养基的酸碱度至PH7.6时，

12、采用0.1NNaOH溶液，而将全部肉汤培养基调至PH7.6时，却改用1NNaOH溶液，为什么？3、普通肉汤与普通琼脂培养基各有什么用途？实验四细菌的分离培养及移植 一、目的要求1、 掌握细菌分离培养的基本要领和常用方法2、 使被检材料适当稀释，以求获得独立单在菌落二、实验材料1、培养基：普通琼脂平板 每人2块 普通琼脂斜面、普通肉汤 每人各1支2、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面、大金混合肉汤、感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的小白鼠3、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、记号笔三、需氧分离培养方法：1、 平板分离培养法：平板划线法、倾注培养法（不常用）2、 芽胞需氧分离培养法：801520分钟杀死不耐

13、热细菌3、 化学药品分离培养法4、 实验动物分离培养法四、实验内容：1、 平板划线法（组织平板）、（金+大）肉汤平板，每人二块2、 肉汤培养（斜面肉汤），每人一支，（大）斜面肉汤3、 斜面移植（斜面斜面），每人一支，（金）斜面斜面接种完标明细菌、日期、自己的记号，置37，恒温箱培养24小时（平板倒置），第二天抽时间看培养结果。五、作业1、 何谓纯培养？分离纯培养的目的何在？2、 在挑取固体培养物上的细菌作平板划线时，为什么每次都要将接种环上剩余的细菌烧掉？3、 为什么要把培养皿倒置培养？1、 平板划线法（组织平板）、（金+大）肉汤平板，每人二块2、 肉汤培养（斜面肉汤），每人一支，（大）斜面肉

14、汤3、 斜面移植（斜面斜面），每人一支，（金）斜面斜面一、目的要求1、掌握细菌分离培养的基本要领和常用方法2、使被检材料适当稀释，以求获得独立单在菌落实验材料菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面 大肠杆菌金黄色葡萄球菌混合肉汤实验动物：感染了大肠杆菌金黄色葡萄球菌的小白鼠培养基：普通琼脂平板、斜面、二、需氧分离培养方法 1、平板划线分离培养法：平板划线法、倾注培养法（不常用） 2、芽胞需氧分离培养法：801520分钟杀死不耐热细菌，再接种至平板 3、化学药品分离培养法：抑菌作用 杀菌作用 鉴别作用 4、实验动物分离培养法：本种动物或小鼠三、实验内容1、平板划线法（金黄色葡萄球菌+大肠杆菌肉汤平板

15、），每人一块，小鼠肝脏平板，每人一块2、肉汤培养（斜面肉汤），每人一支，大肠杆菌斜面肉汤3、斜面移植（斜面斜面），每人一支，金黄色葡萄球菌斜面斜面标记接种完毕标明细菌、日期、自己的记号，试管置37，恒温箱培养24小时（平板倒置），第二天下午抽时间看培养结果。作业1、何谓纯培养？分离纯培养的目的何在？2、在挑取固体培养物上的细菌作平板划线时，为什么每次都要将接种环上剩余的细菌烧掉？3、为什么要把培养皿倒置培养？实验五 细菌的 生化试验一、 目的要求：1、了解细菌生化试验在细菌学诊断上的重要意义 2、掌握几种生化试验的方法二、实验材料大肠杆菌产气杆菌变形杆菌兔沙门氏菌微量发酵管试剂等三实验内容及操

16、作1、 糖或醇发酵试验2、靛基质（吲哚）试验：将细菌接种于蛋白胨水的试管中置温箱中，37培养24-48h取出试管加乙醚1ml，振荡沿壁加45滴对二甲基氨基苯甲醛，观察结果。3、甲基红（MR）试验：将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水的试管中置温箱中，37培养24-48h取出试管加甲基红45滴，摇匀。4、VP试验：将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水的试管中置温箱中，37培养24-48h取出试管加VP甲液0.6ml摇匀加VP乙液0.2ml，5min 之内看结果。5、 枸椽酸盐利用实验6、 硫化氢实验7、 尿素实验8、 细菌运动试验四作业：1、 生化反应记录表2、 解说你所做的生化反应各种原理3、 以上生化反应试验哪

17、几个是分解糖？哪几种是分解蛋白质？糖发酵试验原理 多糖单糖丙酮酸酸性产物(或产酸产气)pH 指示剂呈酸性变色(若产气者有气泡出现)培养基：微量发酵管试剂：溴甲酚紫(pH7.0紫色- pH5.4黄色）结果:培养基是否有酸性变色(变黄)应用：观察细菌对糖度的 分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定糖发酵试验结果判断反应现象结果描述酸性变色、有气泡分解糖产酸、产气用“”表示酸性变色、无气泡分解糖产酸、不产气用“+”表示培养基不变色不分解糖用“-”表示糖发酵试验枸橼酸盐利用试验原理：某些细菌能利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一的碳源，也能利用其中的铵盐 作为唯一碳源，细菌生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐和分解铵盐

18、生成的氨，使培养基变碱，是指示剂呈碱性反应。培养基：枸盐酸盐微量生化管(草绿色)试剂：溴麝香草酚蓝（pH6.0以下呈黄色，pH7.6以上呈蓝色）结果：培养基变蓝：+ 培养基不变色：应用：肠杆菌科属间鉴别枸橼酸盐利用试验结果判定 阴性(-) 阳性(+)硫化氢试验原理：细菌分解蛋白质中的含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐或铅盐结合生成黑色的硫化铅或硫化亚铁。培养基：含硫酸亚铁或醋酸铅的培养基结果：培养基 变黑 + 为阳性， 不变黑 - 为阴性应用：常用于肠道杆菌的鉴定硫化氢试验结果判定 阴性(-) 阳性(+)尿素酶试验原理：产生脲酶的细菌，能水解尿素生成氨和CO2，氨使培养基呈碱性变色

19、。培养基：尿素培养基试剂：酚红指示剂结果：培养基变红：+ 培养基不变色：应用：肠杆菌科属间鉴定尿素酶试验结果判定 阳性(+) 阴性(-)靛基质试验(吲哚试验)原理：细菌若含有色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质。培养基：蛋白胨水试剂：靛基质试剂（含对二甲基氨基苯甲醛）结果：加入试剂后，培养基出现红色液面：+ 培养基液面为黄色： 应用：用于肠道杆菌的鉴定靛基质试验甲基红试验原理：细菌分解糖，产生丙酮酸，进一步生成大量混合酸，使培养基pH维持在4.4以下，加入甲基红后，使甲基红呈现红色反应。此为甲基红试验阳性。培养基：葡萄糖蛋白胨

20、水试剂：甲基红试剂(pH4.2红色- pH6.3黄色）结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+ 培养基不变色： 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌甲基红试验V-P试验原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基结合，生成红色化合物。培养基：葡萄糖蛋白胨水结果：加入试剂后，培养基呈现红色：+ 培养基不变色： 应用：是肠道杆菌常用的生化反应试验，主要用于区别大肠肝菌和产气肠杆菌运动性试验原理：有的细菌有鞭毛，能运动，可在半固体培养基中观察其运动性培养基：半固体培养基结果:只在穿

21、刺线上生长，周围透明，说明无鞭毛；穿刺线四周模糊，有鞭毛。结果判定与记录1靛基质试验（吲哚试验）取出试管（蛋白胨水）乙醚1ml，振荡，静置，待分层后沿管壁加入对二甲基氨基苯甲醛2-3滴，静置，在分界处出现红色玫瑰吲哚为阳性。2葡萄糖蛋白胨水一分为二（1）甲基红（MR）试验：取出试管加入甲基红3-5滴，摇匀，培养基变红色为阳性，不变色为阴性（2）VP试验：取出试管VP甲液0.6ml，摇匀再加VP乙液0.2ml，摇匀，15min后看结果，变红为阳性，不变为阴性，橙色为结果不可信，需重做。生化反应记录表葡乳麦甘蔗H2S尿素枸椽MRVP吲哚运动性大肠杆菌产气杆菌变形杆菌兔沙门氏菌实验六 药敏试验一目的

22、要求学会药敏试验的操作方法及观察抑菌的范围二实验材料1、菌种：金黄色葡萄球菌大肠杆菌炭疽杆菌2、药敏纸片：青霉素链霉素庆大霉素氯霉素呋喃妥因罗红霉素复方新诺明 3、95%酒精缸、小镊子、普通琼脂平板三每人两块平板接种某种细菌，致密划线四结果判断:根据药敏纸片周围有无抑菌圈及其大小来判断五作业1、 什么叫细菌对抗菌药物的敏感度，了解它有何实际意义？2、 就你所做的药敏试验中，何种抗菌药对何种菌种最敏感？操作步骤1、每人取两块平板，接种某种细菌，致密划线2、用小镊子取药敏纸片贴于培养基上3、置37培养24小时观察结果结果观察根据抑菌圈的大小判断细菌对药物的敏感程度：高敏、中敏、低敏和不敏感实验七

23、病毒鸡胚培养一、目的要求掌握鸡胚接种技术和收获病毒方法。二、实验材料9-11日龄白壳鸡胚，ND病毒，灭菌注射器，棉球(酒精、碘酊)。三、内容及操作1 尿囊腔接种(绒毛尿囊腔)：选9-11日龄鸡胚 先观察鸡胚发育情况：照蛋，取血管丰满者 划出气室位置， 离气室边缘下部5mm避开大血管作一记号，定为注射入口。 消毒打孔：记号处和气室顶端各打一孔，先用碘酊再用酒精消毒，由顶部由里至外。 吸取病料(ND病毒)，由注射入口小孔刺入3-5mm，注射0.1-0.2ml病毒，拔出针头，以棉花蘸取石蜡涂布注射孔，石蜡封闭两孔(先封下面，再封上面) 蛋壳注明日期，学号以及病毒名称 置37温箱中孵育（相对湿度保持在

24、45%60% ）24h内死亡或血管不清者(病料未增殖)弃去，以后每日照蛋两次，死胚置4冰箱保存，96h不死者将其冻死。血管冻后会收缩。 冷冻后收获尿囊液检查。2 绒毛尿囊膜接种法：9-13日龄鸡胚3 羊膜腔接种法：11-12日龄鸡胚4 卵黄囊接种法：6-7日龄鸡胚尿囊液的收取气室消毒击破气室卵壳并弃去无菌小镊撕去壳膜再撕绒毛尿膜(不撕破羊膜）用镊子轻轻按住胚胎，无菌吸管吸取尿囊液置无菌青霉素瓶中待检测。写上学号 姓名 ND尿囊液实验八 病毒的血凝试验（HA）及血凝抑制试验(HI)一、目的要求 掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。二、实验材料 1、新城疫病毒 2、1%鸡红细胞 3、生理盐水 4、新城疫阳性血清 5、96孔“V”型微量反应板三、实验内容 1、HA试验术式表： 2、HI试验术式表：四、作业 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？ 2、HI试验是不是特异的抗原抗体反应？为什么病毒的红细胞凝集试验（HA）一、 概念病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。二、应用当动物感染某病毒而发病时，可