GST亲和层析介质使用说明书

1、GST 亲和层析介质使用说明书一、简介GST 亲和层析介质Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S转移酶GST 融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。本产品是自主设计合成的 GST 琼脂糖凝胶,具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好,易于放大，是研发与生产的理想选择.二、性能参数特点基质吸附载量 最大流速pH 范围使用温度保存温度保存液体化学稳定性基团密度高，载量大6%的交联琼脂糖凝胶15mg GST 融合蛋白（55kDa）/ml100m300cm/h310,在位清洗时pH 范围可到 211常温+48 20乙醇0。1M柠檬酸（pH4.0)，0.1MNaOH

2、，70%6M2h，蛋白结合能力不受影响三、适用范围分离谷胱甘肽 S转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白四、操作说明1。缓冲液配制缓冲液A（平衡缓冲液)：10mMNa2HPO4，1。8mMKH2PO4，140mMNaCl，2。7mMKCl,调节pH值至8.0。缓冲液洗脱缓冲液还原型调节pH值至8.0.因Glutathione易氧化需现用现配。（注：各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 m 滤膜过滤备用)。2。样品预处理：按每克湿重菌体/25ml 平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体；600w 3s3s次,破碎菌体；4、15000rpm 15m0.

3、45m滤膜过滤.3。装柱：聚苯乙烯层析柱1）,于水面下方,在保持水平的状态下,小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡.2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片 11。5cm 高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将介质加入到层析柱中；静置 30min，让介质自然沉降。（对实验结果要求不严,也可不放入上垫片，以提高流速)。在使用一段时间后,如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质,垫片后,2）、3）所述玻璃层析柱1) ;,58cm .2） 先将介质混匀,用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将介质加入到层

4、析柱中；静置 30min， 让介质自然沉降。3) ,气泡。4）,装柱。过柱：10A过柱,平衡介质；上样；3）510倍介质体积缓冲液A过柱,洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质；510倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液；510倍介质体积缓冲液A重新平衡介质.注:纯化过程流速不宜过快,对于 1ml 介质,流速保持在 0.5ml/min 为宜。介质清洗如果在使用一段时间后,介质因表面沉积过多杂质导致蛋白结合能力下降,需对介质进行清洗.步骤如下：沉淀或变性物质的清洗：用 2 倍介质体积 6 M 盐酸胍清洗，然后用 5 倍介质体积缓冲液A 平衡介质。疏水缔合物质的清洗：34 702 1TritonX-1

5、00）5 倍介质体积缓冲A 平衡介质。6。 介质再生每次层析前，为达到最佳纯化效果，需对介质进行再生,步骤如下：2倍介质体积高pH缓冲液（0。1MTris-HCl,0。5MNaCl,pH8。5）和低pH缓冲液（0。1Msodiumacetate,0。5MNaCl,pH4。5)交替洗脱三次。10倍介质体积缓冲液A平衡介质。7.SDS检测:1)SDSPAGE分离胶分离范围分离胶浓度分离范围分离胶浓度分离范围650150kD83090kD10%2080kD12%1260kD151040kD2）SDS操作流程A。每个胶孔最适蛋白上样量为510g。B。将含510g蛋白的样品溶液与loadingbuffe

6、r混匀,90孵育5min，取出后5000rpm离心1min。C.上样,15mA、30mA80V、120V恒压电泳。8。介质保存48条件下，介质可长期保存于20%乙醇中五、GST Agarose分离GST融合蛋白实例层析介质：GST 1ml；对照GST 介质（国际领先品牌）1ml样品：表达可溶性 GST-tag 融合 thioredoxin 的大肠杆菌 BL21 裂解液结合缓冲液：10mM Na2HPO4，1。8mM KH2PO4，140mM NaCl，2。7mM KCl,pH 8。0洗脱缓冲液:10 mM Glutathione（还原型）, 50 mM TrisHCl， pH8。0流速:GST

7、 1ml，0。5ml/min；对照 GST 介质 1ml，0.5ml/min实验结果：色谱分析结果见图 1,色谱各组分的SDS结果见图 2。图 1 GST Agarose 分离 GST 融合蛋白色谱图1。低分子量 Marker;2.上样液;3。GST-流穿液；4。GST洗脱液;5。对照-流穿液；6.对照-洗脱液123456图2纯化后SDS图六、GST亲和层析介质使用注意事项1. GST ,510mM DTT 24h，再装柱，用平衡缓冲液进行重新平衡、洗脱等操作。2。不同的GST 融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要时对流穿液、洗脱液进行SDS以及

8、Western 杂交分析，以确定最佳纯化条件。3。GST 融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用介质进行纯化。纯化效果取决于复性效率.4。纯化后出现杂带的常见原因目标蛋白断裂或酶解解决方案:A 和缓冲液B 1mM PMSF 0.1%TritonX100 01Tween-20 等稳定剂.GST融合蛋白不完全表达GST GST GST 标签蛋白连同完全表达的融合蛋白均能与介质结合并被洗脱下来26KD .解决方案：尝试用不同浓度的还原型谷胱甘肽洗脱;优化表达条件，降低 GST 融合蛋白不完全表达量；改变外源基因在载体中插入的酶切位点，重新构建表达载体；在不改变外源基因两端