免疫标记的技术

1、关于免疫标记技术第1页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四 根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称免疫标记技术。 ( immunolabelling technique)第2页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四 高敏感性的标记分子主要有荧光素、酶、放射性同位素，由此建立了免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫分析等技术。特点：敏感性高、特异性强应用：微生物鉴定、传染病诊断、生物活性物质的测定、基因表达产物的检测。第3页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四第一节 免疫荧光抗体技术Immunofluorescence antib

2、ody technique 指用荧光素对抗体进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。Coons等1941年建立该技术，当时用荧光黄标记，但效果不好，故不能推广。第4页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四 当发现异硫氰酸荧光素（FITC）被发现后，以及荧光抗体纯化技术的发展，显著提高了荧光抗体技术的敏感性和特异性，故得到广泛应用。用于病原检测、疫病诊断等第5页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四1 原理： 荧光素在超微浓度下，亦能被短波长光激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。 是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的敏感性以及显微镜技术

3、的精确性等相互结合的一种免疫检测技术。第6页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四2 荧光素 为一种化学染料。常用于标记的荧光素有：异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RB 200）、四甲基异硫氰酸罗丹明，其中FITC最常用。第7页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四作为标记荧光素需满足的条件：（1）有与蛋白分子形成稳定共价键的化学基团，且不形成有害产物。（2）荧光效率高，与蛋白结合的需要量小。（3）标记后不影响抗体的活性（4）性质稳定，易保存（5）激发的荧光与背景颜色有良好的反差。（6）标记简单，能形成商品第8页，共58页，2022年，5月20日，9点

4、48分，星期四3 荧光抗体染色方法（1）标本制备涂片或亚印片：细菌培养物、感染动物的组织、血液、脓汁切片：感染组织盖玻片：上面培养单层细胞标本要求很薄，并要保持抗原的完整性第9页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四（2）固定 常用丙酮和95%乙醇，室温固定1530min，后用PBS反复冲洗，干后即可染色。 固定目的：防止被检材料从玻片上脱落；消除标本内抑制抗原抗体反应的因素；检测细胞内的抗原，用有机溶剂固定，有利于荧光抗体渗入。第10页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四（3）染色方法 有直接法和间接法两种直接法：A 在标本上滴加24个单位的标记抗体，置湿盒

5、中，37作用30minB 在大量PBS中漂洗15min，第11页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四C 干燥D 封载 滴加缓冲甘油，用盖玻片封盖检测中，要设阳性、阴性标本对照缓冲甘油：分析纯甘油9份加PBS 1份第12页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四直接法 猪链球菌2型MRP的鉴定A 猪链球菌2型肉汤培养物涂片，凉干B PBS漂洗5 minC 加入FITC标记的抗MRP抗体，置湿盒中， 37作用30 minD PBS漂洗5 minE 干燥、封载第13页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四图2A MRP单抗介导FITC标记SS2表面MR

6、P的激光共聚焦图像图2B SS2多抗介导FITC标记的SS2的激光共聚焦图像AB第14页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四A 在标本上滴加抗SFV血清，置湿盒中，37 作用30 minB PBS漂洗5 minC 加FITC标记的抗抗体，置湿盒中，37作用 30 minD PBS漂洗E 干燥、封载间接法（如检测猪淋巴结中的SFV）第15页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四4 荧光显微镜观察第16页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四（1）细菌学诊断 可直接检测或鉴定新分离的细菌，具有较高的敏感性和特异性。 动物粪便、黏膜拭子涂片、病变组织

7、触片或切片、尿沉渣等均可作为样本 对含菌少的样本，可采用滤膜聚菌法，然后在滤膜上进行免疫荧光染色5 免疫荧光技术的应用第17页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四（2）病毒病诊断 直接检测病变组织中的病毒，是病毒病诊断的常用手段。如猪瘟、鸡传支 猪流行性腹泻和传染性胃肠炎，临床症状相似，但将猪小肠做切片，即可区分 对于猪瘟等不出现细胞病变的病毒，免疫荧光可作为病毒增殖的指征第18页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四（3）其他应用 免疫荧光广泛应用于淋巴细胞CD分子和膜表面免疫球蛋白的检测，用于淋巴细胞的分型；借助于流式细胞计数技术，可以评价机体细胞免疫状况

8、。如佐剂刺激机体细胞免疫功能增强，可通过检测T细胞上的CD表达量来证实第19页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四第二节 免疫酶标记技术 是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立的免疫检测技术。 1966年，Nakane报道用酶代替荧光素标记抗体，建立酶标记抗体技术，用于组织中抗原的定位。 第20页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四1971年，Engvall报道酶联免疫吸附试验，建立免疫酶定量检测技术。 1980年后，建立了检测和鉴定蛋白质的免疫转印技术。第21页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四一、原理 酶是有机催化剂，

9、微量的酶可催化大量的化学反应，如果产物为有色可见物，则极为敏感。 E+S (ES) E+P 如果产物没有颜色，则可通过供氢体显色，来显示反应的发生。E+S (ES)， (ES)+D1 E+P+D2第22页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四 D1为供氢体，无色，底物水解时，D1由还原型变为氧化型D2，呈现颜色反应。第23页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四基本程序1 酶分子与抗原或抗体分子共价结合2 酶标抗体或抗抗体与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异结合，并洗下未结合的物质。3 滴加底物溶液，底物在酶作用下显色；或底物不显色，但在底物水解过程中，由另外

10、的供氢第24页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四体提供氢离子，使供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，呈现颜色反应。4 根据颜色变化判断反应的发生。第25页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四二、用于标记的酶标记酶应具有的特征：1 高度的特异活性和敏感性；2 在室温下稳定；3 易于获得并能商品化生产；4 与底物反应的产物易于显现第26页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四（一）辣根过氧化物酶 广泛分布于植物中，辣根中含量最高，称（horseradish peroxidase,HRP)。 其作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢体。 供氢体主要

11、有：邻苯二胺（OPD）、联苯二胺（DAB）、四甲基联苯胺（TMB）第27页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四OPD的氧化产物可溶解于水，呈橙色，最大吸收波长为490nmTMB 产物溶于水，呈兰色，加氢氟酸终止反应，在650nm测定；用硫酸终止，呈黄色，450nm下测定DAB的氧化产物不溶于水，呈黄褐色第28页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四（二）碱性磷酸酶（AKP）从牛小肠黏膜和大肠杆菌中提取底物常用对硝基苯磷酸盐，酶解产物呈黄色，可溶解，最大吸收波长400nm。第29页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四三、常用的免疫酶标记技术（一

12、）免疫组织化学染色1 标本制备 与免疫荧光相同2 标本处理 用1%3%的H2O2甲醇处理标本，低温条件下，作用1015分钟，可同时起到固定和消除内源酶的作用。第30页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四3 封闭 10%卵白蛋白（OVA）或0.05%Tween-80和含有1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS对标本处理30min，能消除背景颜色。4 染色方法 可采用直接法、间接法等，与免疫荧光方法相似。第31页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四（二）酶联免疫吸附实验Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 将抗原或抗体吸附

13、于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。1 载体 聚苯乙烯微量滴定板最常用，有96孔、 40孔以及酶标条。第32页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四2 包被 将抗原或抗体吸附于固相表面的过程。大多数 抗原易吸附在表面。用碳酸盐缓冲液包被，4过夜或37吸附23h。3 洗涤 用含0.05%Tween-80的PBS第33页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四4 实验方法直接法 用于测抗原 （如沙门氏菌）（1）待检抗原包被（2）洗涤35次，每次35min（3）封闭 含1%OVA的PBS（pH7.2，浓 度为10mmol）（4）洗涤

14、 同上（5）加酶标记的抗沙门氏菌的单抗， 置湿盒中，37作用12h（6）洗涤 同上（7）加底物显色，测OD值第34页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四间接法：用于测抗体（如测AIV抗体）（1）AIV病毒包被（2）洗涤35次，每次35min（3）封闭 含1%OVA的PBS（pH7.2，浓 度为10mmol）（4）洗涤 同上（5）加待检抗体，置湿盒中， 37作用12h（6）洗涤 同上（7）加酶标记抗抗体，置湿盒中， 37作用12h（8）加底物显色，测OD值第35页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四夹心法 （又称双抗体法，用于测抗原）（1）抗AIV多抗包被（2

15、）洗涤35次，每次35min（3）封闭 含1%OVA的PBS（pH7.2，浓度为10mmol）（4）洗涤 同上（5）加待检抗原，置湿盒中， 37作用12h（6）洗涤 同上（7）加酶标记抗AIV单抗，置湿盒中， 37作用12h（8）加底物显色，测OD值第36页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四双抗体夹心法（1）抗AIV多抗包被（2）洗涤35次，每次35min（3）封闭 含1%OVA的PBS（pH7.2，浓度为10mmol）（4）洗涤 同上（5）加待检抗原，置湿盒中， 37作用12h第37页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四（6）洗涤 同上（7）加抗AIV单

16、抗，置湿盒中， 37作用 12h（8）洗涤 同上（9）加酶标记抗AIV单抗，置湿盒中， 37作 用 12h（10） 洗涤，加底物显色，测OD值第38页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四结果判定：P/N2.1 判为阳性 实验中，要设置阳性对照、阴性对照、空白对照。实验时，先用空白对照孔调零。第39页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四其他ELISA技术1 阻断ELISA2 酶标抗原竞争法3 酶标抗体直接竞争法4 SPA-ELISA5 Dot-ELISA第40页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四第三节 放射免疫分析 Radioimmunoa

17、ssay(RIA) 是将放射性同位素测量的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来而建立的一种免疫分析技术。 第41页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四 1959年Yalow和Berson共同建立了该技术，可精确地测定体液中微量活性物质的量。1977年获诺贝尔奖。 具有特异性强、灵敏度高、准确性好等优点。第42页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四一、原理 放射性同位素核衰变时，会发出、射线，或从核外俘获一个正电子。各种射线均可用仪器检测，且灵敏度很高。 3H放出射线，能量低，用液体闪烁计数器检测；32P、35S放出中等能量的射线，125I放出射线，均可用井型

18、计数器检测。第43页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四1 竞争性RIA原理 定量分析微量半抗原物质均采用该法。 同时在溶液中加入标记抗原（*Ag）、非标记抗原（Ag）和抗体（Ab），使*Ag与Ag竞争性地与Ab结合，根据免疫沉淀物中， *Ag.Ab的减少来测定Ag的量。第44页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四 *Ag+Ab *Ag-Ab + Ag Ag-Ab 当反应体系中存在一定量的*Ag和Ab 时，结合型*Ag-Ab(B)和游离型*Ag（F）的比例是一定的，他们保持着可逆的动态平衡。第45页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四 在此

19、反应液中加入待检的Ag，则 Ag与*Ag竞争地与Ab结合，Ag的量越多，B/F的比值或B%越小。 因此，只要把反应液中的B和F分开，然后分别测定B和F的放射性，即可计算出B/F值和结合百分率（B%）。第46页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四 用已知浓度的标准物（Ag）和一定量的*Ag、Ab反应，测出不同浓度Ag下的B/F，以标准物的浓度为横坐标，以B/F为纵坐标，即可绘制竞争性抑制反应曲线。 实验中，测出待检抗原的B/F，即可在标准曲线上查出其含量。第47页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四2 固相夹心RIA 与夹心ELISA的原理相似，以一定量的抗体

20、包被反应管，然后加入系列稀释的待检抗原，最后加入放射性同位素标记的抗体，计数结果。根据标准样品制备的标准曲线进行定量测定。其只能检测完全抗原。第48页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四3 放射免疫检测 与免疫酶组织化学染色法的原理相似。用放射性同位素标记抗原或抗体，加入到组织制片或固定检样上，用放射自显影以显示组织或固定检样中相应的抗原或抗体的位置。 可进行定性和定位检测。第49页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四二 标记用的同位素作为标记用的同位素需满足以下条件：1 为低序号的常见元素2 放射强度低或中等3 半衰期适中（既能保证检测时间，又便于环境处理）。 第50页，共58页，2022年，5月20日，9点48分，星期四三、常用放射免疫分析技术（一） 液相放射免疫测定 放免通常指液相法1 试验基本过程：（1）适量处理待测样品（2）按一定要求加样，使待测抗原与标记抗原竞相与抗体结合（3）反应平衡后，加入分离剂，将B和F 分开第51页