单基因遗传性疾病分子诊断课件

1、单基因遗传性疾病的分子诊断1SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity单基因遗传性疾病的分子诊断1SchoolofLaborato 遗传性疾病主要分为两大类：符合孟德尔遗传规律的单基因遗传病(特点:病种多、在特定家系中发病率高、对群体的影响小)不符合孟德尔遗传规律的多基因遗传病（又称多因素性疾病，特点：病种相对较少、不仅在特定家系中发病率高、而且对群体的影响大）2School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical Universit

2、y 遗传性疾病主要分为两大类：2School of Labo单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，有6600多种，并且每年在以10-50种的速度递增，单基因遗传病已经对人类健康构成了较大的威胁。较常见的有红绿色盲、血友病、白化病等。 3School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，有6600多种，单基因遗传病常染色体显性遗传病常染色体隐性遗传病X连锁显性遗传病X连锁隐性遗传病Y连锁遗传病4School of Laboratory Medicin

3、e and Life Science, Wenzhou Medical University单基因遗传病常染色体显性遗传病4School of Labo常染色体显性遗传病位于常染色体上的两个等位基因中，如有一个突变，这个突变基因的异常效应就能显示发病。特点：遗传与性别无关，男女发病机会均等；患者双亲往往有一方为患者。家族性多发性结肠息肉、多指、并指等。5School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University常染色体显性遗传病位于常染色体上的两个等位基因中，如有一个突常染色体隐性遗传病致病基因为位于常染

4、色体上的隐性基因，当隐性基因纯合时才能发病。即隐性遗传病 单基因遗传病患者，大多是由两个携带者所生的后代。特点：男女发病机会均等，发病与性别无关；双亲为无病携带者，子女发病概率为25%；常是越代遗传；近亲婚配时，子女中隐性遗传病患病率大为增高。先天性聋哑、白化病、苯丙酮尿症等。6School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University常染色体隐性遗传病致病基因为位于常染色体上的隐性基因，当隐性X连锁显性遗传病特点：女性发病率高，这是由于女性有两条X染色体，获得这一显性致病基因的概率高之故，但病情较男性轻

5、。男性患者病情重，他的全部女儿都将患病。抗维生素D佝偻病、家族性遗传性肾炎等。7School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical UniversityX连锁显性遗传病特点：女性发病率高，这是由于女性有两条X染色X连锁隐性遗传病 特点：女性携带，男性患病。男性的致病基因只能随着X染色体传给女儿，不能传给儿子，称为交叉遗传。血友病A。病因：血浆中抗血友病球蛋白减少，AHG即第因子凝血时间延长。临床表现：轻微创伤即出血不止，不出血时与常人无异。血友病B。病因：血浆中缺乏凝血酶成份PTC，即第因子。临床表现同血友病A。色盲。

6、临床表现：全色盲对所有颜色看成无色，红绿色盲为不能区别红色和绿色。进行性肌营养不良。病因：为原发性横纹肌变性并进行性发展。临床表现：初为行走笨拙，易跌到，登梯及起立时有困难，从仰卧到起立必须先俯卧，双手撑地，再用两手扶小腿、大腿才能站起。进行性肌肉萎缩，但一般不累及面部及手部肌肉。8School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical UniversityX连锁隐性遗传病 特点：女性携带，男性患病。男性的致病基因只Y连锁遗传病 Y连锁遗传病的特点是男性传递给儿子，女性不发病。因Y染色体上主要有男性决定因子方面的基因，其他

7、基因很少，故Y连锁遗传病极少见。目前已经知道的Y伴性遗传的性状或遗传病比较少，肯定的有HY抗原基因、外耳道多毛基因和睾丸决定因子基因等。 9School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical UniversityY连锁遗传病 Y连锁遗传病的特点是男性传递给儿子，女性不发病 遗传病的诊断方法可以简单的分为以下的四类：1.分子水平的诊断：包括限制性片段长度多态性的酶切分析、基因型和单体型的连锁和关联分析、基因的序列分析。2.细胞水平的诊断：采用细胞遗传学技术进行染色体核型分析，比如荧光原位杂交法。3.蛋白质水平的诊断：采用

8、生物化学方法分析异常表达的蛋白质或代谢产物。4.疾病动物模型的辅助诊断：建立相应的转基因疾病动物模型，辅助诊断或判定人类疾病的致病基因。10School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University 遗传病的诊断方法可以简单的分为以下的四类：10School所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突变有关，对这类疾病进行分子诊断有两种策略可供选择： 1. 直接诊断策略； 2. 间接诊断策略11School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medi

9、cal University所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突变有关，对这类疾病进行分遗传性疾病分子诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变，如基因的缺失、插入、倍增或者是点突变等遗传缺陷。因此直接诊断的前提是被测基因已经克隆，其核酸序列和结构已被阐明。12School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University遗传性疾病分子诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术直接检1、点突变的诊断 直接诊断策略和方法：直接检测基因点突变：等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO）、

10、PCRELISA、等位基因特异性扩增（ASA）、PCRRFLP、基因芯片技术等；基因背景未知的点突变：单链构象多态性（SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DEEG）、异源双链分析（HA）、DNA序列测定、蛋白截短测试等。 13School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University1、点突变的诊断 直接诊断策略和方法：直接2、片段性突变的检测片段性突变是指DNA分子中较大范围的碱基发生突变，如碱基的缺失、插入、扩增和重组。对于少数核苷酸缺失或插入，可以采用检测点突变的方法，而对于大的片段突变，则使用South

11、ern印迹技术和多重PCR技术。 14School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University2、片段性突变的检测片段性突变是指DNA分子中较大范围的间接诊断策略和方法：采用多态性连锁分析的方法，寻找具有基因缺陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍体型等，并判定被检者是否有这条存在基因缺陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍体型等。15School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University间接诊断策略和方法：采

12、用多态性连锁分析的方法，寻找具有基因缺医疗机构临床检验项目目录（2013年版）检验项目1462项：一、临床体液、血液专业（360项）二、临床化学检验专业（347项）三、临床免疫、血清学专业（458项）四、临床微生物学专业（152项）五、临床分子生物学及细胞遗传学检验（145项） 16School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University医疗机构临床检验项目目录（2013年版）检验项目1462五、临床分子生物学及细胞遗传学检验1、感染性疾病分子生物学检验（89项）2、疾病相关分子生物学及细胞遗传学检验（

13、25项）3、肿瘤分子生物学检验（17项）4、用药指导的分子生物学检验（10项）5、其它（4项）17School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University五、临床分子生物学及细胞遗传学检验1、感染性疾病分子生物学检2、疾病相关分子生物学及细胞遗传学检验染色体核型分析染色体荧光原位杂交分析脆性X染色体核型分析羊水细胞染色体分析高分辨染色体核型分析绒毛组织染色体分析姐妹染色体互换分析染色体分析21三体和性染色体多倍体检测单基因遗传病基因突变检测遗传性肌营养不良基因分析地中海贫血基因突变检测肝豆状核变性基因分

14、析地中海贫血基因突变检测血友病基因分析苯丙酮尿症的基因突变检测脆性X综合症基因分析遗传性耳聋基因检测Y染色体性别基因分析HLA低分辨基因分型检测脱氧核糖核酸倍体分析HLA中分辨基因分型检测血细胞荧光原位杂交分析HLA高分辨基因分型检测未经处理的羊水细胞荧光原位杂交分析18School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University2、疾病相关分子生物学及细胞遗传学检验染色体核型分析染色体荧主要内容血红蛋白病 杜氏肌营养不良症 血友病 苯丙酮酸尿症 成年型多囊肾19School of Laboratory M

15、edicine and Life Science, Wenzhou Medical University主要内容血红蛋白病 19School of Laborato导致单基因病产生的基因突变类型基因突变点突变密码子插入或缺失移码突变外显子缺失或重复基因倒位基因融合动态突变20School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University导致单基因病产生的基因突变类型基因突变点突变密码子插入或缺失针对单基因病基因突变的分子诊断技术DNA杂交基因酶谱连锁分析寡核苷酸探针杂交PCR基因芯片DNA测序21School

16、 of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University针对单基因病基因突变的分子诊断技术DNA杂交基因酶谱连锁分析分子诊断的时机症状前诊断产前诊断着床前诊断症状后诊断22School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University分子诊断的时机症状前诊断产前诊断着床前诊断症状后诊断22Sc 一、血红蛋白病 血红蛋白的构成：2条珠蛋白（141aa）和2条珠蛋白（146aa）23School of Laboratory Medic

17、ine and Life Science, Wenzhou Medical University 一、血红蛋白病 血红蛋白的构成：2条珠蛋白（141aa）（一）珠蛋白基因簇的结构珠蛋白基因簇：16Pter -p13.3 24School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University（一）珠蛋白基因簇的结构珠蛋白基因簇：16Pter -p1珠蛋白基因簇：11p15.5 25School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical Univ

18、ersity珠蛋白基因簇：11p15.5 25School of La（二）镰状细胞贫血症的分子诊断镰状细胞贫血是一种常染色体显性遗传血红蛋白(Hb)病。临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛危象以致慢性局部缺血导致器官组织损害。也是严重危害母子健康的疾病,可使胎儿死亡率达5%，孕妇死亡率达4.62% 。26School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University（二）镰状细胞贫血症的分子诊断镰状细胞贫血是一种常染色体显性因-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，构成镰状血红蛋白(HbS)，取代了

19、正常Hb(HbA)。在氧分压下降时HbS分子间相互作用，成为溶解度很低的螺旋形多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞（镰变）。27School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University因-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，构成镰状血红蛋白纯合子型：SS，完全没有正常的HbA, 预后严重，只有14%活到成年，而多死亡于30岁前。杂合子型：AS，即正常HbA与异常HbS相混。在非洲有35%的病人是AS型基因；其变化悬殊，轻者可活至成年，重者可反复出现危象发作。 28School of Laboratory M

20、edicine and Life Science, Wenzhou Medical University纯合子型：SS，完全没有正常的HbA, 预后严重，只有14%病因：珠蛋白基因点突变ACCTGAGGAGSCCTGTGGAG 29School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University病因：珠蛋白基因点突变29School of Labora镰状细胞贫血的分子诊断方法 Mst IICCTG AGGCCTG TGG突变型野生型1.15kb0.2kb1.35kb30School of Laboratory

21、 Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University镰状细胞贫血的分子诊断方法 Mst IICCTG AGGCC限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检测1.35 kb1.15 kb0.2 kb31School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检测1.35（三）地中海贫血的分子诊断地中海贫血又称海洋性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血，是一组遗传性溶血性贫血疾病。由于遗传的基因缺陷致使血红

22、蛋白中一种或一种以上珠蛋白链合成缺如或不足所导致的贫血或病理状态。本病广泛分布于世界许多地区，东南亚即为高发区之一。我国广东、广西、四川多见，长江以南各省区有散发病例，北方则少见。32School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University（三）地中海贫血的分子诊断地中海贫血又称海洋性贫血、珠蛋白生根据所缺乏的珠蛋白链种类及缺乏程度予以命名和分类。分为型、型、型和型4种，其中以和地中海贫血较为常见。 33School of Laboratory Medicine and Life Science, We

23、nzhou Medical University根据所缺乏的珠蛋白链种类及缺乏程度予以命名和分类。分为型、 地中海贫血：大多数是由于珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。 各种表型的地中海贫血的基因型表型基因型正常人/静止型地中海贫血/标准型地中海贫血 /Hb H病（4）/ Hb Barts（胎儿水肿综合症，4） / 2121134School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University 地中海贫血：大多数是由于珠蛋白基因的缺失所致，少数由基基因突变：缺失为主遗传方式： 不完全显性遗传？- -/-

24、 -/- -/- -35School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University基因突变：缺失为主？- -/- -/- -/- - 地中海贫血的基因诊断BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe基因簇限制性酶切片段和分子杂交探针36School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University 地中海贫血的基因诊断BamHIBamHI212 1限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检测14kb

25、10kbaa/aaaa/a-aa/- -a-/- - -/- -37School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检测14kb地中海贫血 ：主要是由于基因的点突变，少数为基因缺失。 LCRGA1IVS-IIVS-II基因簇和基因的结构38School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University地中海贫血 ：主要是由于基因的点突变，少数为基因缺失。 L基因缺

26、失和有些点突变可致链的生成完全受抑制，称为0地贫；有些点突变使链的生成部分受抑制，则称为+地贫。39School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University基因缺失和有些点突变可致链的生成完全受抑制，称为0地贫；地贫基因突变较多，迄今已发现的突变点达100多种，国内已发现28种。其中常见的突变有6种： 41-42（-TCTT )，约占45%； IVS-654 ( C T )，约占24%； 17 ( A T )；约占14%； TATA盒- 28 ( A T )，约占9%； 71-72（+A ), 约占2%

27、； 26( G A )，即HbE26，约占2%。40School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University地贫基因突变较多，迄今已发现的突变点达100多种，国内已发 突变类型 分子缺陷 人群1核苷酸取代(1) -28核苷酸ACTATA区转录信号突变，+中国人(2) IVS-1第1核苷酸GA拼接接头突变，导致RNA加工缺陷，0地中海地区人(3) IVS-1第5核苷酸GC共有顺序突变导致RNA加工缺陷，+印第安人(4) IVS-2第654核苷酸CT内含子变化导致RNA加工缺陷，0中国人(5) 第17密码子

28、AT无义突变导致无功能RNA，0中国人(6)Hb Knossos(27丙丝)编码区突变导致RNA加工缺陷，+地中海地区人2 核苷酸插入 密码子71-72间插入1bp移码突变导致无功能mRNA，0中国人3 核苷酸缺失密码子4142(-4)缺失移码突变导致无功能mRNA，0中国人41School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University 突变类型 分子缺陷 人群1核苷酸取代(1遗传方式：不完全显性遗传/0/00/042School of Laboratory Medicine and Life Scien

29、ce, Wenzhou Medical University遗传方式：不完全显性遗传/0/00/042Sc在b珠蛋白基因第2内含子第654位核苷酸CT突变（IVS-II-654 CT ，简称b654），是中国人所特有的，而且是最常见的b地贫基因突变之一。654*ABCmRNA(N)mRNA(M)IVS IIVS II57973bpIVS IIVS IIb-globin geneb654 mRNA的剪接模式43School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University在b珠蛋白基因第2内含子第654位核苷酸

30、CT突变（IVS-654基因突变的分子诊断RT-PCR法诊断剪切异常Normal Patient 254bp181bp轻型重型44School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University654基因突变的分子诊断RT-PCR法诊断剪切异常Nor654基因突变的分子诊断PCR-ASO方法杂交不杂交不杂交杂交正常杂合子轻型重型45School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University654基因突变的分子诊断PCR-A

31、SO方法杂交反向点杂交同时诊断基因多个点突变M1 M2 M3 M4 M5 M6 正常探针突变探针 基因芯片技术现在已经开发了多种诊断地贫的芯片检测阅读系统，系统多采用国际先进的PCR体外扩增结合DNA芯片反向点杂交检测技术，可快速准确检测全血样本中珠蛋白基因上多个基因位点的突变 46School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University反向点杂交同时诊断基因多个点突变M1 M2 二、杜氏肌营养不良症（DMD）肌营养不良症由于遗传方式的不同大致可分为以下几类：X染色体隐性遗传的Duchenne型和良性的

32、Becker型常染色体显性遗传的面-肩-肱型常染色体隐性遗传的肢带型在各型肌营养不良症中，Duchenne型发病率最高，病情也严重，常早年致残并导致死亡，是遗传性肌萎缩症中最有代表性的疾病。 47School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University二、杜氏肌营养不良症（DMD）肌营养不良症由于遗传方式的不同杜氏肌营养不良是一种X染色体隐性遗传疾病，主要发生于男孩。据统计，全球平均每3500个新生男婴中就有一人罹患此病。患者在学龄前就会因骨骼肌不断退化出现肌肉无力或萎缩，导致不便行走。大概在7岁到12

33、岁时，会彻底丧失行走能力，通常到20多岁就会因为心肌、肺肌无力而死亡。针对该病，医学界尚无有效疗法。48School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University杜氏肌营养不良是一种X染色体隐性遗传疾病，主要发生于男孩。4（一）遗传方式和DMD基因突变 遗传方式：XRDMD基因定位于Xp21.2，是目前已知人类最大的基因，包括79个外显子 基因缺失是DMD发生的主要原因（约占60%70%） 49School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou

34、Medical University（一）遗传方式和DMD基因突变 遗传方式：XR49SchooXp21.2-p21.1Xp21.2-p21.1（二）杜氏肌营养不良症的分子诊断 多重PCR技术诊断DMD基因缺失Chamberlain设计了9对引物，可同时扩增第4、8、12、17、19、44、45、48和51号外显子Beggs设计了9对引物，可同时扩增启动子、第3、6、13、43、47、50、52和60号外显子18对引物的多重PCR扩增可以检测出DMD基因的98%缺失患者 51School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medi

35、cal University（二）杜氏肌营养不良症的分子诊断 多重PCR技术诊断DMD基53PatientsSt(-)(+)12345DMD GENEagfbhcdea b c d e f g h 53PatientsSt(-)(+)12345DMD G单基因遗传性疾病分子诊断课件多重PCR诊断DMD基因外显子缺失I：外显子45缺失 II：外显子48缺失 III：正常对照54School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University多重PCR诊断DMD基因外显子缺失I：外显子45缺失 II： 多重探针连接

36、扩增Multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA) 测序：Sanger双脱氧链末端终止法二代基因测序技术，如杂交测序法（SBH）56School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University测序：56School of Laboratory Medi血友病为一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血。三、型血友病 57School

37、of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University血友病为一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，其共同的特征是活1.血友病A（血友病甲），即因子促凝成分（：C）缺乏症，也称AGH缺乏症，是X染色体隐性遗传疾病。2.血友病B（血友病乙），即因子缺乏症，又称PTC缺乏症、凝血活酶成分缺乏症，亦为X染色体隐性遗传。3.血友病C（血友病丙），即因子（F）缺乏症，又称PTA缺乏症、凝血活酶前质缺乏症。为常染色体不完全隐性遗传。1520/10万男孩中有发病，此发病率在所调查的不同的种族和地域之间没有差异。发病率以血友病A最多

38、占85%，血友病B占15%，血友病C罕见。58School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University1.血友病A（血友病甲），即因子促凝成分（：C）缺乏症，（一）F的基因结构 F基因位于X染色体长臂末端（Xq28），包括26个外显子和25个内含子，全长186kb 。包括26个外显子和25个内含子，其mRNA全长约为9kb，cDNA为9009bp。其翻译产物为 2351个aa残基的多肽链。59School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou

39、Medical University（一）F的基因结构 F基因位于X染色体长臂末端（Xq28（二）型血友病 的遗传方式和基因突变遗传方式：XR已报道F基因点突变174种，缺失117种，插入10种。由于导致HA F基因的点突变多，故在实际工作中不可能对每一病人作点突变的检测，所以DNA多态性的连锁分析仍然是型血友病基因诊断的常用手段。 60School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University（二）型血友病 的遗传方式和基因突变遗传方式：XR60ScA型血友病的分子诊断PCR-RFLP连锁分析法61Sc

40、hool of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical UniversityA型血友病的分子诊断PCR-RFLP连锁分析法61Scho血友病A （Hemophilia A, HA）99bp43bp142bpBcl IBcl I142bp血友病A （Hemophilia A, HA）99bp43b63School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University63School of Laboratory MedicinAmp-FLP在FV区内

41、尚有两个VNTP区，一个位于DXS52，另一个位于DX102内，它 仍均具有复杂的多态性，亦可用于连锁分析。64School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical UniversityAmp-FLP在FV区内尚有两个VNTP区，一个位于D其他诊断方法PCR-SSCPPCR-DGGE65School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University其他诊断方法PCR-SSCP65School of Labo四、苯丙酮酸尿症（PKU） （一）苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变 编码PAH的基因发生突变，致使PAH活性降低或丧失 PAH突变种类达440余种，涉及13个外显子，突变的80%发生在外显子512编码区 中国人的PAH基因突变类型30余种，已确定20多种，大约占所有基因突变类型的80% 66School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University四、苯丙酮酸尿症（PKU） （一）苯丙氨酸羟化酶（PAH）基苯丙酮酸尿症的遗传方式：ARaaAa Aa67School of Laboratory Medicine an