基因定点突变简介

1、基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。二、定点突变的原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以 是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包 括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的 目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是 实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关 系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失 或者插入，可以改变对应的

2、氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进 行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。 而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫 外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改 造，现在的 GFP 能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度 比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技 术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活 性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是 稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物

3、研发、基因治疗等等方面。通过设计引物，并利用 PCR 将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就 是我们的 PCR 产物，在 PCR 产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛 选阳性克隆，再测序确定就行了。三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。突变引物设计的特殊原则：通常引物长度为2545 bp,我们建议引物长度为3035 bp。一般都 是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp 才能与模板搭上，而这种突变 PCR 要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各 设至少12个bp，并且合

4、成多一条反向互补的引物。如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是 否达到78C(GC含量应大于40%)。如果Tm值低于78C,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78C (GC 含量应大于 40%)。设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位臵。最好使用经过纯化的引物。Tm 值计算公式:Tm=0.41x(% of GC)- 675/L+81.5注：L:引物碱基数；% of GC:引物GC含量。四、引物设计实例以GCGf ACG为例： 5-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中

5、央位置。Primer #1: 5-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3Primer #2: 5-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3引物GC含量为40%, L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式， 得到其Tm=75.5 (Tm=0.41x40-675/30+81.5)。通过计算可以看出其Tm低于 78C，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。重新调整引物长度。Primer #1:5-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3Primer #2:5-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATAC

6、TGAAGGAGG-3在引物两端加5mer (斜体下划线处)，这样引物的GC含量为45.7%, L 值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952(Tm=0.41x47.5-675/35+81.5),这样的引物就可以用于突变实验了。五、突变所用聚合酶及 Buffer引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer, 不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K所以要 用那些GC buffer或扩增长片段的buffer,另外，要用保真性能较好的PFU酶 来扩增,防止引进新的突变。除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene和塞

7、百盛的试剂盒，但价格 昂贵。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的 PrimeSTARTMHS DNA polymerase。六、如何去掉 PCR 产物最简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我 们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基 化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而 PCR 产物都是没有甲基化 的，所以 DpnI 酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响 PCR 产物，从而 去掉模板留下 PCR 产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。DpnI 处理的时间最好长一点，最少一个小

8、时吧，最好能有两三个小时，因 为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就 会导致实验失败。七、如何拿到质粒直接把通过 DpnI 处理的 PCR 产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性 克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。八、图示Mulcted* h I: Digested by *Mulcted* h I: Digested by *: Mulazyma :Stp 1. Inducing mu-atlpn -PCR reaction -ijsin Muta-dlfecfdigssteii J1 -Jslng iutazymNot transfonndX Ira

9、 nsformqllo nH -Jsir compater ccNidc re covering j九、定点突变操作步骤A诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。设计点突变引物。注参考引物设计指导准备模板质粒 DN A注用dam+型菌株（例如DH5a菌株）作为宿主菌。在end+型菌株中常有克 隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本 公司的质粒提纯试剂盒。选项对照反应体系（50|jl反应体系）10 xReaction Buffer5plpUC18 control plasmid (

10、10ng/|jl,total 20ng)2plControl primer mix (20pmol/pl)2pldNTP mixture (each 2.5mM)2pldH O238Muta-direct Enzyme1pl样品反应体系（50|jl反应体系）10 xReaction Buffer5plSample plasmid (10ng/pl,2pltotal 20ng)Sample primer (F)(10pmol/|jl)1plSample primer (R)(10pmol/pl)1pldNTP mixture (each 2.5mM)2pldH O238Muta-direct E

11、nzyme1plPCR反应条件注按如下参数设置PCR扩增条件。CyclesTemperatureReaction Time1cycle95 r30sec15cycle95 r30sec55 r1min72 r1min per plasmid KbPCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。注按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。注意当突变点位点超过 4 个时会发生突变率降低的现象。MutationCycles12Nucleotide15cycles3Nucleotides18cycles突变质粒选择PCR反应结束后使用Mutazyme酶消化甲基化质粒从而选择突变质

12、粒DNA。准备PCR反应产物加入 1|jl(10U/|jl)MutazymeTM酶 37C温育 1 小时。注当质粒DNA用量过多时Mutazyme酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme酶用量。转化反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH5a。将10|Jl样品加到50pl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。接下来可以参照一般的转化步骤进行。序列分析通常当 LB 平板上出白色菌落则表明发生了突变。为了证实这一结果，我们建议对白色

13、单菌落进行测序分析。 本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技 术以后会慢慢奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。 实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个 碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做： 第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因 好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列 或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多 吧， Taq 酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效

14、能强，缺点就是保真性差， 其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉 如果是 2000bp 的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当 然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位臵更换碱基的保守序列，或者改 造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也 是那些研究基因的人经常的一种思路吧。对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位臵是不是重要的位臵，如 果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并 没有引起相应氨基酸的改变

15、，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在 NCBI 上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不 同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个 相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然 后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU,或者PCR 循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突 变。对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说 明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什

16、么注意之类的话，看都 不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增 出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把 这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。大家马上就会想到几个问题了：第一：引物怎么设计呢？第二：模板怎么去掉呢？第三：怎么拿到质粒呢？ 对于第一个问题：怎么设计引物？ 我只能讲一些原则，并举一些例子。引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了： 不过这种突变引物要加上一个原则： 一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为 11-12base pair。若两边引物太短了，很可能会造成突

17、变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭 上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。 这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：X71661.1TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAG AGGAATTCCAG 960现有序列TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924|deletionX71661.1AAGGGCCACCCCGACCTC

18、CAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTT GAGAGTGTAGGAGAT 1020现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTT GAGAGTGTAGGAGAT 984（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配） 我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成 引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量不至过低，也使引物退火温度升 高。故合成引物 CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG 并合成反向互补引

19、物 CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG 其实也不定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同 时符合引物设计的原则就行了。引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有些 差别，不过价钱般都是块多个碱基，合成时间约为周。这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链完整， 另链有缺刻的 PCR 产物 对于第二个问题： 怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并 将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒 般都被甲基化保护起来（除非你用

20、的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都 是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR 产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化 缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。关于第三个问题：直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳 性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧），验证突变结果， 般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有做不出来的，呵呵， 不要砸我啊。下面讲下具体的实验步骤以及些实验中要注意的事情：1、根据现有基因设计引物；2、合成引物并准备好模板；3、PCR，4、DpnI 处理酶切产

21、物；5、转化酶切产物；6、筛选 阳性克隆；7、送测序并测全长。最后就是庆祝啦，呵呵，没什么复杂的。引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer, 不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K所以要 用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶 来扩增，防止引进新的突变。那种Quick change试剂盒分为几种不同的类型什么 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 标准点突变试剂盒、QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Ki

22、t 长模板单点突变试剂盒（8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较 适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。另外，Dpnl处理的 时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得 不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。 实验板长出来的菌有两种可能种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的（突变体）不过这两种菌长得一模一样A_A，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无 法区分），除了测序，是分不出来的，做PCR时也最好做一负对照（不加引物），实验管由于PCR时有引

23、物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产 物，而对照管由于 PCR 时没放引物，所以在 DPNI 处理前里面只有模板。 如果两者都拿去DNPI处理就能够证明模板已经被去除干净。若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌，那么就是 DpnI 没处理好， 如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出 问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了 问题，那就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转 化有没问题。如果正对照很多菌，负对照有几个菌，那么就是DPNI处理得不干净，这个时候 就得靠

24、运气了 A_A大家有什么问题我们可以继续讨论。另外，如果大家既没有DpnI酶也没有好的PCR酶和BUFFER的话，那也有其 它办法进行定点突变，只是麻烦一点，如果大家有需要的话，我会把方法贴上来。 对于多点突变技术及较长片段的缺失插入技术，同样的，如果大家有需要的话， 我会把方法贴上来。不过，如果你有钱的话，那就去买那个试剂盒吧，其中 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 标准点突变试剂盒 、QuikChange XLSite-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（8kb）的原理我上面 已经说了，只是补充了一些我认为的

25、注意事项。如果你更有钱的话，那么你可以 叫其它公司帮你做定点突变服务，大约是改一个点1000元左右。如果有需要我 可以提供公司的联系方式。下面我以一个例子为例来讲100个bp以下的碱基插入缺失或者改变实验方案。 其实这种方案并不是那么好的，只不过考虑到大家一般都没有TYPEII限制性内切 酶或者UDG and NTHIII （另外两种方法），所以才打算先介绍这种方法。首先先说明一点，这种 方法在原理上存在一定成功机率，也就是说有运气成分。而定点突变则一般都是百分之百成功的，而这种100bp以下的插入缺失或者碱 基改变可能要测几个克隆才能挑到一个好的克隆，大家如果要用请慎重考虑。 同样的，我只变

26、那几十个碱基，并没有改变载体及其它地方，所以我还是依赖于 DPNI 酶。举例：Homo sapiens FzE3 是一个人类基因，其含有32个氨基酸的信号肽MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGA，后面是成熟肽QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLD QAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGG PGGGPTAYPTAPYLPDLPFTALPPGASDGRGRPAFPFSCPRQ

27、LKVPPYLGYRFLGERDCGAPC EPGRANGLMYFKEEERRFARLWVGVWSVLCCASTLFTVLTYLVDMRRFSYPERPIIFLSGCYF MVAVAHVAGFLLEDRAVCVERFSDDGYRTVAQGTKKEGCTILFMVLYFFGMASSIW WVILSLTWFLAAGMKWGHEAIEANSQYFHLAAWAVPAVKTITILAMGQVDGDLLSGVCY VGLSSVDALRGFVLAPLFVYLFIGTSFLLAGFVSLFRIRTIMKHDGTKTEKLEKLMVRIGVFSVLYTVPATIVLACYFYEQAFREHWERTWLLQTCK

28、SYAVPCPPGHFPPMSPDFTVFMIKYLMTMIVGITTGFWIWSGKTLQSWRRFYHRLSHSSKGETAV,想在信号肽和成熟肽之间插入 个FLAG标签并在标签前面加上一个Leucine。即在信号肽和成熟肽之间插 入一段序列：TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG （共三十个 bp）、实验设计：信号肽：ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGTTCCGCTTTCGTCCCTGGGCTTCT GTGCCCTGGTGCTGGCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCG 成熟肽：CAGCCGTACCACGGAGAGAAGGGC

29、ATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCT GTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAAC CAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCC CGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCC ATCCCGCCGTGTCGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGAGGCGCTCATG AACAAGTTCG

30、GCTTCCAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGCGTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGGCCCACTGCCTACCCTACCGCGCCCTACCTGCCGGACCTGCCCTTCACCGCGCTGCCCCCGGGGGCCTCAGATGGCAAGGGGCGTCCCGCCTTCCCCTTCTCATGCCCCCGTCAGCTCAAGGTGCCCCCGTACCTGGGCTACCGCTTCCTGGGTGAGCGCGATTGTGGCGCCCCGTGCGAACCGGGCCGTG

31、CCAACGGCCTGATGTACTTTAAGGAGGAGGAGAGGCGCTTCGCCCGCCTCTGGGTGGGCGTGTGGTCCGTGCTGTGCTGCGCCTCGACGCTCTTTACCGTTCTCACGTACCTGGTGGACATGCGGCGCTTCAGCTACCCAGAGCGGCCCATCATCTTCCTGTCGGGCTGCTACTTCATGGTGGCCGTGGCGCACGTGGCCGGCTTCTTTCTAGAGGACCGCGCCGTGTGCGTGGAGCGCTTCTCGGACGATGGCTACCGCACGGTGGCGCAGGGCACCAAGAAAGAGGGCTGCACCATCC

32、TCTTCATGGTGCTCTACTTCTTCGGCATGGCCAGCTCCATCTGGTGGGTCATTCTGTCTCTCACTTGGTTCCTGGCGGCCGGCATGAAATGGGGCCACGAAGCCATCGAGGCCAACTCGCAGTACTTCCACCTGGCCGCGTGGGCCGTGCCCGCCGTCAAGACCATCACTATCCTGGCCATGGGCCAGGTAGACGGGGACCTGCTGAACGGGGTGTGCTACGTTGGCTTCTCCAGTGTGGACGCGCTGCGGGGCTTCGTGCTGGCGCCTCTGTTCGTCTACTTCTTCATAGGCACGTCCT

33、TCTTGCTGGCCGGCTTCGTGTCCTTCTTCCGTATCCGCACCATCATGAAACACGACGGCACCAAGACCGAGAAGCTGGAGAAGCTCATGGTGCGCATCGGCGTCTTCAGCGTGCTCTACACAGTGCCCGCCACCATCGTCCTGGCCTGCTACTTCTACGAGCAGGCCTTCCGCGAGCACTGGGAGCGCACCTGGCTCCTGCAGACGTGCAAGAGCTATGCCGTGCCCTGCCCGCCCGGCCACTTCCCGCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTCTTCATGATCAAGTGCCTGATGACCATGA

34、TCGTCGGCATCACCACTGGCTTCTGGATCTGGTCGGGCAAGACCCTGCAGTC GTGGCGCCGCTTCTACCACAGACTTAGCCACAGCAGCAAGGGAGAGACCGCGGTATGA插入序列TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG通过引物3端大于或等于 18 个碱基的匹配使引物与模板质粒搭配，再通过引物5 端的序列来补上那三十个碱基，先用 PNK 酶把引物磷酸化，再用下面这两条 引物把整个质粒给扩增出来，上游和下游引物就刚好把那三十个碱基给补上了， 再参照引物的设计原则做一些润色，细心的朋友可以具体分析一下这两条引物。扩出来后再用DPNI酶把模板质粒去掉，再用连接酶把PCR产物的两端连接起 来（虽然是平端连接，可是由于是同一条PCR产物的两端连接，效率会很高）， 转化后，测序验证， OK。设计引物forward primer:GGACTACAAAGACGATGACGACAAGCAGCCGTACCACGGA GAGAAG88.5reserve primer: ATTAACGCCCCGGCGCCCGCGGACAGT86.9但是由于引物的合成是由 3端向5端