双水相萃取的技术

1、关于双水相萃取技术第1页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四第一节 概述1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现聚合物的不相容性:把明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时，得到一种不透明的混合溶液，静置后分为两相，上相含有大部分水，下相含有大部分琼脂（或淀粉），而两相的主要成分都是水. 1955年，瑞典伦德大学的Albertsson首次利用双水相技术从单细胞藻类中分离淀粉核，从此开创了双水相分配技术。1979年德国GBF的Kula和Kroner等3人将双水相体系用于提取酶和蛋白质，使胞内酶的提取过程大为改善。 第2页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星

2、期四一、基本概念及分类 双水相系统:某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两个不相混溶的水相。聚合物-聚合物-水系统:聚合物分子的空间阻碍作用使相互间无法渗透 。聚合物-无机盐-水系统:盐析作用。第3页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四为什么会形成双水相？聚合物之间的不相容性:聚合物分子的空间阻碍作用使相互间无法渗透，从而在一定条件下分为两相。只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可发生相分离，并且水溶性差别越大，相分离倾向也就越大。 某些聚合物的溶液在与某些无机盐等低分子质量化合物的溶液相混时，只要浓度达到一定值，也会产生两相。其形成机理是由于盐析作用

3、。 第4页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四双水相系统分类双聚合物体系：聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)/葡聚糖（dextran，Dx）；聚丙二醇（polypropylene glycol）/聚乙二醇；甲基纤维素（methylcellulose）/葡聚糖等。聚合物和无机盐体系：PEG/磷酸钾（略作KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等 第5页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四类型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非离子型聚合物/非离子型聚合物聚乙二醇聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、甲

4、基聚丙二醇、羟丙基葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮羟丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖乙基羟基纤维素葡聚糖甲基纤维素羟丙基葡聚糖、葡聚糖高分子电解质/非离子型聚合物羧甲基葡聚糖钠盐聚乙二醇高分子电解质/高分子电解质葡聚糖硫酸钠羧甲基纤维素钠羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠非离子型聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇非离子型聚合物/无机盐聚乙二醇磷酸钾、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、酒石酸钾钠、甲酸钠第6页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四与一般的水-有机溶剂体系相比较有什么不同？双水相体系中两相的性质差别（如密度和折射率等）较小。由于折射率的差别甚小，有时甚至都难于发现它们的相界面。两相间的界面张力也

5、很小，仅为10-510-4 N/m（一般体系为10-3210-2 N/m）。 第7页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四三、双水相萃取技术的基本特点两相的性质差别（如密度和折射率等）较小 两相间的界面张力也很小 （一）条件温和，体系具有生物亲和性（二）所需溶液少，操作方便（三）分离迅速，步骤简便（四）操作易于控制（五）可简化分离步骤 （六）能进行萃取性的生物转化（七）亲和萃取（亲和分配）可大大提高分配系数和萃取专一性 （八）易于工艺的连续化生产 第8页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四第二节 双水相分配原理及其理论基础一、双水相系统分配原理 是否会形成双水

6、相，取决于混合熵增和分子间作用力两个因素。混合是自发的熵增过程，而分子间相互作用力则随分子量的变大而增强。当两种高分子聚合物之间互不相溶时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成富含两种不同聚合物的两相。 第9页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四上、下相的组成取决于两种聚合物（如PEG/Dx）的加入量以及其分子质量的大小。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。 分配系数 K

7、不同而分离第10页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四相图 双水相形成条件和定量关系可用相图表示。双结点线：把均相区和两相区域分隔开。 系线：连接双结点线上两点的直线。 临界点：当系线长度趋向于零时，即在图中的K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，成为单相体系。KPi质量分数/%PEG质量分数/%均相区两相区系线第11页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四在同一条系线上的各点分成的两相具有相同的组成，但体积比不同。当上下两相间密度差小时，两相的体积近似服从杠杆规则。第12页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四按表格重复操作P

8、EG400 0.700g H2O 0.5ml (NH4)2SO4混和 H2O 0.3/0.5ml浑浊记录(NH4)2SO4 ml数混均绘制相图实验操作澄清旋涡器绘制相图PEG400% (NH4)2SO4%第13页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四二、双水相中的分配平衡溶质在双水相中的分配系数也用K=cT/cB表示。 分配系数是各种相互作用的和. lnKP=lnKE+lnKS+lnKA 总分配系数KP: lnKE、lnKS、lnKA分别为静电作用、疏水作用、亲和作用对溶质分配系数的贡献。 在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相，在同一条系线上的不同点

9、，物质的分配系数相同。 第14页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四（一）静电作用lnK=lnKo+FZ/RTKo为溶质静电荷为零时的分配系数；F为法拉第常数；Z为溶质的静电荷数；为相间电位差。 荷电解质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比. 分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异,同一双水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同 带负电荷的蛋白质在双水相种的分配系数K : K+ Na+ NH4+ Li+ (C4H9)4N+ ClO4- SCN- I- Br- Cl- CH3CO2- F- H2PO4- HPO42- 第15页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期

10、四（二）疏水作用一般情况下，蛋白质的表面均存在疏水区，疏水区所占比表面越大，其疏水性越强。不同组分由于其表面疏水性的差异使得其各自在上下相中产生相应的分配平衡。 lnKsHF(RH +B) HF为相间的疏水性差，也称疏水性因子；RH为氨基酸的相对疏水性；B为比例常数。 lnKo=HFHFS HFS蛋白质的表面疏水性.（pH=pI时）lnK0HF(HFS+HFS) HFS为盐浓度增加引起的HFS值增量。 lnKHF(HFS+HFS)+ FZ/RT 第16页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四（三）界面张力作用 非电解质型溶质在液体中的界面张力的存在使它呈不均匀分布，并聚集在双水

11、相体系中具有较低能量的一相中。 非电解质型溶质的分配系数与相间表面自由能差及溶质的分子量有关 lnKP=-E/kT-M/RT 溶质的分配系数的对数与其分子量呈线性关系 同一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变 第17页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四（四）亲和作用 通过一定的方法，将配基连接在双水相的成相物质分子上，就构成了具有亲和性质的双水相体系，形成对被分配物质的亲和作用，调节待提取物在两相中的分配，从而提高其分离效果 过渡金属离子:Cu2、Ni2、Fe2、Zn2、Co2等是常用的亲和配基 作用机理:配位键力、-键及静电作用力 第18页，共39页，2022年，5月2

12、0日，2点50分，星期四四、影响物质分配平衡的因素除了静电作用、疏水作用及界面张力等各种相互作用因素外，影响物质在双水相系统中分配的因素主要还有:双水相系统的聚合物组成(包括聚合物类型、平均分子量)盐类(包括离子的类型和浓度、离子强度、pH值)溶质的物理化学性质(包括分子量、等电点)体系的温度等。 第19页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四（一）双水相中聚合物组成当两种不同浓度的聚合物与聚合物或者聚合物与无机盐以不同的浓度混合时，可能存在三种情况：a、完全混溶性(匀相溶液)；b、物理的不相溶性(相分离)；c、复杂的凝聚(相分离，聚合物聚集在同一相中，纯溶剂-水聚集在另一相中

13、) 当这两种聚合物是离子化合物并带有相反电荷时，它们互相吸引并发生复杂的凝聚。 不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性 水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄糖硫酸盐甲基葡萄糖葡萄糖羟丙级葡萄糖甲基纤维素聚乙烯醇聚乙二醇聚丙三醇。 第20页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四（二）成相聚合物分子量同一聚合物的疏水性随分子量的增大而增大。对于PEG/Dextran所形成的双水相体系中，若降低PEG相对分子质量，则生物分子分配于富含PEG的上相中，使分配系数增大；而降低Dextran相对分子质量，则分配系数减小。 对于同种聚合物而言，其疏水性随相对分子质量增加而增加 若想在上

14、相获得较高的蛋白质收率，对于PEG聚合物，应(? )它的平均相对分子质量。第21页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四（三）成相聚合物的浓度聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的长度为零,此时分配系数为1，即组分均匀的分配于上下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增大，系线的长度增加，系统远离临界点，成相聚合物两相性质的差别也增大，组分在两相中的分配系数改变。 成相物质的总浓度越高，系线越长，生物分子越容易分配于其中的某一相.第22页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四其它因素 1.分配物质的分子量 2.盐的种类和浓度 3.pH值影响 4.温

15、度的影响 5.通气和搅拌的影响 M10-4第23页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四第三节 双水相萃取操作及设备一、 双水相系统的选择:易于两相的分离. 根据待分离蛋白质和共存杂质的表面疏水性、分子量、等电点和表面电荷等性质上的差别，来选择双水相系统，并确定成相聚合物的分子量及浓度、盐的浓度、pH值等因素以确定最佳的萃取系统。 第24页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四对于目标蛋白与杂蛋白的表面疏水性相差较大的体系，可利用盐析等作用原理，通过提高成相系统的浓度，增大双水相系统的疏水性，达到目标蛋白与杂蛋白的分离。 对于目标蛋白质与杂蛋白的等电点不同的体系

16、，添加适当的盐，并通过调节系统的pH值使相间电位差变大，而达到目标产物与杂蛋白的分离。第25页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四PEG/Dx系统 高聚物/盐体系 新的双水相体系:表面活性剂-表面活性剂-水体系、双水相胶束体系等体系 第26页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四二、双水相萃取工艺设计目标物应满足以下条件：与原料液中的杂质应分配在不同的相中 在双水相体系中的某一相中的分配系数应相对较大 双水相系统的上下相应易于分离。 第27页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四工艺流程目的产物的萃取PEG的循环无机盐的循环。 第28页，共39

17、页，2022年，5月20日，2点50分，星期四（一）目的产物的萃取1.如果目标产物在上相中的分配系数足够大，则细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。 一步双水相萃取是把生物材料悬浮液和双水相系统混合后，分离上下相，其中下相含有大多数杂质，而上相再通过超滤操作进行进一步的提纯目标产物，同时高聚物一相可以得到回收。在两步萃取操作中，把一步萃取体系中的上相分离出来后，再加入盐使其形成新的双水相体系，则富含PEG的上相得到回收，同时，含有目标产物的盐相通过超滤等操作得到分离目标，而且可以通过浓缩可以进行回收再利用。 第29页，共39页，2022年，5月20日，2点50

18、分，星期四PEG/盐双水相体系一步或两步萃取流程示意图 第30页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四2.细胞内蛋白质的萃取 双水相萃取法可选择性地使细胞碎片分配于双水相系统的下相，而目标产物分配于上相，同时实现目标产物的部分纯化和细胞碎片的除去，从而节省利用离心法或膜分离法除碎片的操作过程。 如果细胞匀浆液中的目标产物的分配系数较小，则可采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。 第31页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四三步双水相萃取酶的流程示意图 第32页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四（二）PEG循环在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG的回收有两种方法：加入盐使目标产物转入富盐相来回收PEG；将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去PEG，再洗出蛋白质。第33页，共39页，2022年，5月20日，2点50分，星期四（三）无机盐的循环一种方法使将含磷酸钠的盐相冷却到6，使盐结晶析出，然后用离心机分离收