d1 绪论蛋白质工程课件

1、酶与蛋白质工程陶凤云酶与蛋白质工程考查课： 24学时讲课（1-12周），8学时上机（8,9周一下午6-9节615）成绩构成：1、平时（出勤，课堂表现，上机作业及报告、小测验、期中考试等）70%2、期末考试30%作业1：蛋白质（或酶、肽）结构分析文献综述1、查文献，选定蛋白（或酶、肽） 登录号或序列已知，研究背景，重要价值（应用意义、科学理论价值），写出文献综述，列出参考文献。2、第3周交文献综述。作业2：抗菌肽（或蛋白质、酶）分子改造（或分子设计）文献综述1、查文献，选定肽 序列已知，研究背景，意义，别人工作，优点与不足，改造思路。 写出文献综述，列出参考文献。2、第5周交文献综述。作业3：蛋

2、白质结构分析上机1、某一目标序列分析（生物信息学分析） 序列理化性质（分子量，等电点，） 同源分子，序列比对，相似值，系统树图 PDB登录号，三维结构图 家族归属，组织分布等性质2、写出软件或网络服务器网址，用法。3、分析越全面，软件或服务器功能使用越多，成绩越高，可独立完成，也可2-4人一组合作（明确写出分工）。4、最迟第8周上机完成，上机时操作检查。交报告打印版及电子版。一、酶与蛋白质工程的简介定义蛋白质工程是以蛋白质结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术对现存蛋白质加以改造，组建新型蛋白质的现代生物技术。目的：生产性能比自然界存在的天然蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的蛋白质新

3、品种。对蛋白质结构与功能关系的认识基础蛋白质的体外重组表达技术手段2门课程合并为1门基因工程是遵循中心法则 DNAmRNA蛋白质折叠产生功能 基本上是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是按照以下思路进行的： 确定蛋白质的功能蛋白质应有的高级结构蛋白质应具备的折叠状态应有的氨基酸序列应有的碱基排列 可以创造自然界不存在的蛋白质。二、蛋白质工程的研究内容1、蛋白质的结构和功能2、蛋白质的结构、功能设计和预测3、蛋白质的结构修饰1、蛋白质的结构和功能每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，蛋白质功能部位的几个氨基酸残基决定着蛋白质的功能，必须处于一个及其精密的空间状态下才能发挥功能。只要能维持蛋白质结

4、构域的必需氨基酸及空间构象不变，其功能域的生物学活性就会保持不变。改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能通过改变氨基酸达到改造蛋白质的目的。 2、蛋白质分子改造“大改”，设计自然界不存在的全新蛋白质。 “小改”：几个残基的替换；“中改”：大规模地肽链或结构域替换；不同蛋白质的结构域进行拼接组装；1、蛋白质工程的发展简史1982年，Winter等首次报道通过基因定点诱变获得改性酪氨酸tRNA合成酶。1983年，Ulmer在Science上发表了Protein Engineering的专论，标志着蛋白质工程的正式诞生。1982年1985年，Forsht等对酪氨酰tRNA合成酶的分子进行了改造，根据X

5、射线衍射实测该酶与底物结合部位的结构，通过定点突变技术改变与底物结合的aa残基，还用动力学方法测量所得变体酶的活性，深入探讨了酶与底物的作用机制，这就是最早的蛋白质工程。三、蛋白质工程的产生与发展1984年，Perry通过将溶菌酶中Ile3改成Cys3，并进一步氧化成Cys3- Cys97二硫键，提高了酶的热稳定性，显著改进了溶菌酶在食品工业的应用价值。1987年，Forsht将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp99和Glu156改成Lys，而导致活性中心His64质子pKa从7降到6，使酶在pH=6时的活力提高10倍。工业用酶最佳pH的改变预示着其可带来巨大的经济效益。三、蛋白质工程的产生与发展

6、1988年，杜邦公司成功设计合成了由四段反平行-螺旋组成为73个氨基酸残基。通过从头设计，折叠成新蛋白质的目标是可以实现的。举例 通过蛋白质工程来提高重组-干扰素专一活性和稳定性。 人的干扰素的cDNA大肠杆菌中进行表达抗病毒活性为106 U/mg天然产品的十分之一抗病性活性提高到108 U/mg，并且比天然-干扰素的贮存稳定性高很多。-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、31位和141位）干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。虽然在大肠杆菌中合成的-干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。?推测：不正确的二硫键 将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸问题分析原因解决结果（

7、一）蛋白质工程在医学上的应用1）提高蛋白质的稳定性 如葡萄糖异构酶 （GI）突变型比野生型的热半衰期长一倍；最适反应温度提高10-12；酶比活相同 2）融合蛋白质 化学合成的脑啡肽 （Enk）N端5肽编码区，通过一连接3肽编码区与人1型干扰素 IFN基因连接，在大肠杆菌中表达这一融合蛋白 ，融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN 六、蛋白质工程的应用5）嵌合抗体和人缘化抗体 嵌合抗体就是用人抗体的恒定区替代鼠单克隆抗体的恒定区，这样它的免疫原性就显著下降 人源化抗体就是将抗原吸附区域嫁接到人抗体上，这样免疫原性也就最小 。人缘化抗体如治疗脊髓性白血病的ANTICD33等，其免疫反应

8、可以忽略不计。（二）蛋白质工程在农业方面的应用（1）饲料用酶的分子改良与产品研制（2）饲料用抗菌肽的分子改良与产品研制（3）食品用酶及抗氧化酶的分子改良与产品研制（4）有机磷降解酶及毒素解毒酶的分子改良与产品研制（5）重大动物疫病快速检测试剂的研发 （2）饲料用抗菌肽的分子改良与产品研制防御素、Cathelicidin等抗菌肽的分子改良和产品研制， 获得对主要饲料有害真菌和细菌均有高效杀灭作用的广谱抗菌肽， 构建高效表达工程菌，建立高密度发酵技术和产品后加工技术，并确立饲料用抗菌肽的产品标准和应用技术规范，实现产业化生产 。抗菌肽LL-37，hepcidin, transferrin(Tf),

9、 lactoferrin(Lf)蛙皮抗菌肽，马盖宁magainin II，天蚕素，蜂毒素，牛Bac， Smap-29及其衍生肽，细胞穿透肽，杂合肽。 （3）食品用酶及抗氧化酶的分子改良与产品研制 重点开展乳糖酶、超氧化物歧化酶、磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶、弹性蛋白酶的产品研制。 通过分子改良获得具有高比活、耐高温和耐酸碱等优良综合特性的改良酶。 构建高效表达工程菌，完善酶制剂的高效发酵及后加工技术，实现产业化生产（4）有机磷降解酶及毒素解毒酶的分子改良与产品研制通过蛋白质分子改良和修饰技术，改造拥有自主知识产权的有机磷降解酶、黄曲霉毒素解毒酶和N-酰化高丝氨酸内酯降解酶， 获得同时具有催化活性高、pH作用范围宽和广谱降解能力的改良酶， 构建高效表达工程菌,完善高效发酵和后加工技术,建立酶的应用技术体系，实现产业化生产 （5）重大动物疫病快速检测试剂的研发 利用核酸体外扩增技术、基因工程技术、蛋白质工程技术以及单克隆抗体技术，设计表达和大量生产重大动物疫病病原微生物（禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、蓝耳病病毒等）的主要抗原性蛋白及这些抗原性蛋白的特异性单克隆抗体，建立上述蛋白的高密度培养、大规模纯化和质量控制技术。 同