生物制药-第三章-基因工程制药-基因工程药物制造实例和质量控制课件

1、第八节基因工程药物制造实例 一、干扰素 二、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 三、人白细胞介素-2 四、美洲商陆抗病毒蛋白第八节基因工程药物制造实例 一、干扰素 干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为、等4个类型。型干扰素在分为1b，2a ，2b等亚型，其区别表现在个别氨基酸的差异上。 干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分一、基因工程菌的组建构建干扰素工程菌流程图一、基因工程菌的组建构建干扰素工程菌流程图一、干扰素基因工程菌的组建流程诱生的白细胞 提取全

2、RNA 通过寡dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡A的mRNA 离心提取12s 的 mRNA 逆转录成cDNA 双链cDNA接上dT或dG尾 pBR322质粒 pBR322质粒加上dA或dC一、干扰素基因工程菌的组建流程 退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌 扩增杂交质粒 筛选抗青霉素但对氨苄 青霉素敏感细菌克隆用杂交翻译法挑选含干扰素cDNA克隆 将干扰素cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌中进行高效表达生物制药-第三章-基因工程制药-基因工程药物制造实例和质量控制课件二、基因工程干扰素的制备启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提精提 半成品制备 半成品检定 分装冻干 成品检定 成品包装制备基因工程干

3、扰素的工艺流程图二、基因工程干扰素的制备制备基因工程干扰素的工艺流程图三、人2b型干扰素(hIFN2b)工程菌株的组建过程应用PCR的方法，从人的染色体片段制备人2b干扰素的cDNA，将其克隆到pRC23表达载体上，构建成重组表达质粒pMZI2B，并转化大肠杆菌DH5a，组建成工程菌株。由于pMZI2B的2b基因5端起始密码ATG上游编制了一段SD顺序，与PL启动子上连接的SD顺序组成双SD顺序，所以克隆基因的表达水平有明显的提高。三、人2b型干扰素(hIFN2b)工程菌株的组建过程应1. hIFN-2b基因的获得 用于克隆的人2b干扰素基因是应用PCR方法从带有人2b干扰素基因的染色体片段获

4、得的：模板DNA 4ng，引物为50pmol/L，各25L 4dNTP 4L，TaqDNA聚合酶2.5L，10PCR反应缓冲液10L，补水使总反应体积为100L。反应条件：变性温度为94 ，退火温度为50，链延伸温度为72 。共30个循环。1. hIFN-2b基因的获得采用PCR技术扩增的人2b干扰素基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳分离，其片段大小约相当于0.55kb。将该片段插入质粒pGEM-3的EcoR I和BamH I的位点上，转化大肠杆菌DH5a，培养后提取质粒DNA，用引物SP6和T7从两端测定DNA顺序。结果证明其顺序与文献报道的基因顺序是一致的。采用PCR技术扩增的人2b干扰素基因

5、片段，经1%琼脂糖凝胶2重组表达质粒pMZI2B的构建 pGEM-32bB质粒经EcoR I和BamH I双酶解，切下2b-B片段，纯化后克隆到质粒pRC23的EcoR I和BamH I位点上，构建成重组表达质粒pMZI2B(见图)。2重组表达质粒pMZI2B的构建3人2b型干扰素工程菌株的形成与基因的表达 将重组表达质粒pMZI2B转化大肠杆菌DH5a形成工程菌。经37 摇床培养后进行抗病毒活性检测。3人2b型干扰素工程菌株的形成与基因的表达结果表明，具有双SD序列的pMZI2B的抗病毒活性(1.69x104IUmL)，与仅具有单SD序列的pMZI2A(其组建过程同上)的抗病毒活性(3.46

6、xl03IUmL)相比，有显著的提高。这是因为基因的表达水平与转录和翻译两个主要环节密切相关，而SD序列在蛋白质翻译中是核糖体的识别和结合部位，因此，增加SD序列，即增加了蛋白质翻译时核糖体的识别和结合机率。结果表明，具有双SD序列的pMZI2B的抗病毒活性(1.692b干扰素的生产4.发酵 工程菌：SW-IFN-2b/E.coli DH5，质粒用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培养基含1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。摇床培养30，10h，培养发酵罐种子。15L发酵罐培养， 30 ，8h。然后42 ，2-3h即可完成发酵。每隔2h取样测OD或离心去上清称量菌体湿重。2b干扰

7、素的生产 4.产品的提取与纯化 4,000r/min离心30分钟，去上清，得湿菌泥。 湿菌超声破碎，离心，取沉淀部分，溶液处理，离心取上清液，上清超滤浓缩， Sephadex G50 分离。 经SDS检查。 再经DE-52柱纯化人干扰素2b。 4.产品的提取与纯化质量控制标准和要求 半成品检定干扰素效价测定蛋白质含量测定比活性纯度测定相对分子量测定残余外源性DNA含量测定残余血清IgG含量测定质量控制标准和要求 半成品检定残余抗生素活性测定紫外光谱扫描肽图测定等电点测定除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验、热原质试验。 残余抗生素活性测定 成品检定物理性状鉴别试验水分测定无菌试验热原试验干扰

8、素效价测定安全试验 美洲商陆 成品检定物理性状第九节 基因工程药物的质量控制基因工程药物与传统意义上的一般药品的生产不同，首先它是利用活的细胞作为表达系统，所获蛋白质产品往往相对分子质量较大，并具有复杂的结构；许多基因工程药物还是参与人体一些生理功能精密调节所必需的蛋白质，极微量就可产生显著效应(每剂量的用量：白介素-12仅0.1 g， 干扰素也只有1030 g)，任何药物性质或剂量上的偏差，都可能贻误病情甚至造成严重危害。第九节 基因工程药物的质量控制基因工程药物与传统意义上的一基因工程药物需要在宿主细胞中表达的外源基因，在转录或翻译、精制、工艺放大过程中，都有可能发生变化，所以从原料制备过

9、程产品的每一步都必须严格控制条件和鉴定质量，确保产品符合质量标准、安全有效。基因工程药物需要在宿主细胞中表达的外源基因，在转录或翻译、精一、原材料的质量控制 原材料的质量控制是要确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。一、原材料的质量控制应该了解：需要明确目的基因的来源、克隆经过、限制性内切酶酶切图谱、核苷酸序列；应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及其各组成部分(如复制子、启动子)的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标志物；应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性等；应该了解：需阐明载体引人

10、宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是否整合到染色体内及在其中的拷贝数、宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，在生产过程中，启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。需阐明载体引人宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态，如是二、培养过程的质量控制 在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。二、培养过程的质量控制 三、纯化工艺过程的质量控制 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与

11、热原质都控制在规定限度以下。在精制过程中避免宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分等的污染，并用相应的方法进行检测。 三、纯化工艺过程的质量控制四、目标产品的质量控制需要综合利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多门学科的理论与技术所建立起来的鉴定方法，以保证基因工程药品安全有效。四、目标产品的质量控制1、产品的鉴定肽图分析氨基酸成分分析部分氨基酸序列分析重组蛋白质的浓度和相对分子质量测定蛋白质二硫键分析1、产品的鉴定重组蛋白质药物产品常用的鉴定方法重组蛋白质药物产品常用的鉴定方法2纯度分析纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目，它包括目的蛋白质含量测定和杂质限量分析

12、两个方面的内容。(1)目的蛋白质含量测定 测定蛋白质含量的方法可根据目的蛋白质的理化性质和生物学特性来设计。通常采用的方法有还原性及非还原性SDS、等电点聚焦、各种HPLC、毛细管电泳(CE)等。2纯度分析(2)杂质 基因工程产物的杂质包括蛋白质和非蛋白质两类。通常需要检测的杂质及其检测方法见下表。(2)杂质 基因工程产物的杂质包括蛋白质和非蛋白质两类。基因工程产物中常见杂质和污染物及其检测方法基因工程产物中常见杂质和污染物及其检测方法3生物活性测定 生物活性测定是保证基因工程药物产品有效性的重要手段，往往需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。3生物活性测定4稳定性检验药品的稳定

13、性是评价药品有效性和安全性的重要指标之一，也是确定药品贮藏条件和使用期限的主要依据。采用恰当的物理化学、生物化学和免疫化学技术对其活性成分的性质进行全面鉴定，要准确检测在贮藏过程中由于脱氨、氧化、磺酰化、聚合或降解等造成的分子变化。4稳定性检验5产品一致性的保证 以重组DNA技术为主的生物制药是一个十分复杂的过程，生产周期可达一个月甚至更长，影响因素较多。需要对原料生产产品的每一环节都进行严格的控制和质量检定，才能确保各批最终产品都是安全有效、含量和杂质限度一致并符合标准。5产品一致性的保证五、产品的保存1、液态保存（1）、低温保存（2）、稳定pH条件下保存（3）、高浓度保存（4）、加保护剂保存五、产品的保存蛋白质的稳定剂有糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇、有机溶剂等；有些蛋白质在高离子强度的极性环境下才能保持其活性，加入中性盐可稳定这些蛋白质；某些蛋白质表面或内部含有半胱氨酸巯基，容易被空气中的氧缓慢氧化为次磺酸或二硫化物，使蛋白质的电荷或构象发生改变而失活，可加入-巯基乙醇、二硫苏糖醇等，在真空或惰性气体中密闭保存。蛋白质的稳定剂有糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇、有机溶剂等；2、固态保存 固态蛋白质比液态稳定，一般蛋白质含水量降到5