【课件】重组DNA技术的基本工具课件高二下学期生物人教版选择性必修3

1、3.1.1 重组DNA技术的基本工具导入扩增基因工程发展历程1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假

2、说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。从社会中来 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御

3、番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？非转基因番木瓜转基因番木瓜转基因实际就是基因工程，那么什么是基因工程，需要那些工具？一、基因工程 就是按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。1、原 理：基因重组2、操作水平：DNA分子水平3、结 果：定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的生物

4、类型和生物产品1、不同生物的基因为什么能拼接？2、外源基因为什么能在受体细胞中表达？拓展1：(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。相同的遗传信息在 不同的生物体内表达出相同的蛋白质。基因工程诞生的理论基础二、 重组DNA技术的基本工具重组DNA技术的基本工具：（三）分子运输车-运载体分子运输车（一）分子手术刀-限制性内切核酸酶 分子手术刀（二）分子缝合针-DNA连接酶 （一）分子手术刀-限制性内切核酸酶（限制酶） 1、来源： 主要

5、从原核生物中分离纯化来的3、特点 :4、作用部位:特定切点上的磷酸二酯键5、结果：形成黏性末端和平末端 2、种类： 数千种能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。黏性末端黏性末端（1） EcoRI 限制酶的切割 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。EcoRI 只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。平末端平末端（2） SmaI 限制酶的作用SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平

6、末端。 （3） 限制酶的识别序列 限制酶所识别序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线；中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。 在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。资料1限制酶名字的由来 用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。 例如一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示； 如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR。小练习：粘质沙雷氏

7、杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_Sma 1、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。2、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端供体生物细胞取出DNA限制酶目的基因想一想：3、你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主

8、要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。1、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 练习与应用 拓展应用1练习与应用 拓展应用2有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶Spe进行切割，B片段分别用限制酶Hind、Xba、EcoR和Xho进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶

9、Spe切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？Xba因为Xba与Spe切割产生了相同的黏性末端（可互补）G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶切割(EcoR)把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？思考： 缺口怎么办？G C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G两种酶的作用对象是不是一样的？，（二）分子缝合针-DNA连接酶1. 作用：2. 种类： Ecoli DNA连接酶 T4 DNA

10、连接酶将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，（1）Ecoli DNA连接或T4DNA连接酶连接粘性末端即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键（2）T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低（3）Ecoli DNA连接酶与T4DNA连接酶比较：类型来源EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别P72旁栏思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶

11、DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶(4)DNA聚合酶的作用DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键（5）DNA连接酶与DNA聚合酶的比较：拓展2：比较以下几种酶种类作用底物作用部位形成产物DNA连接酶DNA聚合酶限制酶解旋酶DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子DNA分子磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键重组DNA分子新的DNA分子含黏性末

12、端或平末端的DNA片段单链DNA项目内容载体类型作用条件质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等将外源基因送入受体细胞的工具假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能产生预想的性状吗？霍乱弧菌的质粒有多个限制酶切点，你会用它做载体吗？如果载体没有切割位点将会怎样？如何确定目的基因是否进入受体细胞中了？对受体细胞无害有一个或多个限制酶切割位点，供外源基因插入能够在宿主细胞中复制并稳定地保存具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择（三）分子运输车-运载体4、基因工程使用质粒的特点 在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过人工改造的，这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环

13、素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选；大肠杆菌及质粒结构模式图现学现用：选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来1.在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应选择的限制酶为_2.在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应选择的限制酶为_或*酶也会切割酶识别的序列，因此不能选择酶思考讨论 P73（1）剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。（3）不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。限制酶DNA连接酶载体对受体细胞无害；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因；能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、 噬菌体衍生物 、动植物病毒小结基因工程的基本工具作为载体的条件种类:磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 练习与应用1、C 2、A拓展应用(2)不同的限制酶切割可能产