弱反应性标本结果处理及报告课件

1、免疫试验弱反应性标本处理及结果报告皖南医学院弋矶山医院 浦 春免疫测定弱反应性(弱阳性)的 来源临床标本原因CUT-OFF值的设定一. 临床标本原因 可能导致假阳性结果的标本因素内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异嗜性抗体、治疗性抗体、溶菌酶等外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝固不全等 （一）内源性干扰因素 类风湿因子干扰的排除稀释标本改变酶标抗体用变性IgG预先封闭标本中RF测抗原,可加入还原剂如2-巯基乙醇去除RF使用特异的鸡抗体IgY作为酶标或固相抗体 2.补体干扰固相抗体和酶标二抗可因为其在固相吸附及结合过程中，抗体分子发生变构，从而其Fc

2、段的补体C1q结合位点被暴露出来，这样C1q就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现假阳性结果。固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阴性结果或使定量测定结果偏低。 3.异嗜性抗体的干扰天然的异嗜性抗体（IgG）可分为两类:一类（85%的假阳性由其引起）可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛IgG的Fab区域，但不与兔IgG的Fab区结合。另一类（15%的假阳性由其引起）可结合于小鼠、马、牛和兔IgG的FC区表位，但不与山羊和大鼠IgG的FC区表位结合。异嗜性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗而出现假阳性反应。 异嗜性抗体干扰的排除使用特异的兔F(ab)2片段作为固相

3、或酶标抗体。在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的异嗜性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。使用靶特异的非Ig亲和蛋白（Affibody）替代固相或酶标抗体之一。采用噬菌体展示技术展示来自单个金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）联合文库的人IgA结合亲和蛋白，用于IgA的测定，不受异嗜性抗体的影响。使用特异的鸡抗体作为固相和测定抗体。 4.抗鼠Ig 抗体的干扰 抗鼠抗体对使用鼠源性单克隆抗体的酶免疫测定，可产生假阳性结果 5.溶菌酶干扰溶菌酶可与等电点较低的蛋白有强的结合能力。免疫球蛋白等电点约为5，因此，在双抗体夹心法ELISA测定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶标的IgG间形成桥接

4、，从而导致假阳性。 溶菌酶干扰的排除为保证ELISA测定的可靠性，有必要从标本中去除溶菌酶或将其封闭，Cu2+离子和卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶，防止其联接IgG。 1.标本溶血 注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红蛋白，有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。 2.标本被细菌污染细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用细菌的内源性酶会对测定方法产生非特异性干扰。 3.标本贮存时间过长 标本在28下保存时间过长，IgG可聚合成多聚体，在间接法E

5、LISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性。血清标本如是以无菌操作分离，则可以在28下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在70以下。 4.标本凝固不全 血液采集后，血液通常在半小时后开始凝固，1824h完全凝固。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心分离血清，此时因血液没有完全凝固，离出的“血清”并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白原，如将其加入微孔中，在ELISA测定过程中仍可以形成肉眼可见的纤维蛋白，易造成假阳性结果血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。 二. CUT-OFF值 1.相关的基

6、本概念2.CUT-OFF值与“灰区”3.结果的报告基本概念标准差适用于正态分布的标准差（SD），不能泛泛地用于酶免疫测定结果的判定。这是因为阴性参考血清的酶免疫测定值的分布常为非正态分布，呈一正向偏斜。基本概念变异系数重复性（Reproducibility）：一般通过重复两次测定样本来观察。测定下限（Detectability）：是指超过零剂量精密度的最低抗原浓度，可通过 t 分布（一边拖尾，因为此时曲线只有上升趋势）计算在测定下限时的吸光度值的均值差。测定敏感性（Sensitivity): 是指一实验的测定反应对待测物质浓度变化的改变。 基本概念阳性结果的可靠性（预示值）即测定为阳性的标本实

7、际上为阳性的可能性。 =真阳性/（真阳性+假阳性） 100%阴性结果的可靠性则为一份给出阴性结果的样本实际上为阴性的可靠性。 = 真阴性/（真阴性+假阴性） 100% 结果报告需了解的概念一般要考虑的问题: 测定下限 (detection limits) 阳性判定值 (Cut-off values) 敏感性 (Sensitivity) 特异性 (Specificity) 符合率(功效率) (Efficiency) 金标准(“Gold standards”) 2.定性免疫测定的CUT-OFF值 “灰区”的计算“灰区”的范围可通过计算相应于这些Cut-off值的u统计值（假设为正态分布）而得到。例

8、如，阴性血清的Cut-off值0.11相应于阳性血清测定值分布的均值2.21SD，于是，一个t2.21相应于95.4的可信限，因此可疑区域为 4.1；同样，阳性血清的Cut-off值0.08相应于阴性血清测定值分布的均值+1.058SD，可得阴性的“灰区”为14.0。 选择CUT-OFF值的标准 （Galen Gambino建议）敏感性最高: 疾病严重，希望不要漏检，疾病可治，出现假阳性结果不会导致严重的心理或经济问题，治疗不当后果不严重。特异性最高：疾病严重但不可治，漏检无心理或公共卫生问题，或假阳性结果可能引起严重的心理或经济问题（如抗HIV确认实验）。高预示值：在不适当治疗会产生严重后果

9、时。高符合率：疾病严重但可治，假阳性或假阴性结果同等严重时。要在上述指标之间达到一个适当平衡，试剂研制需检测三个人群的样本：感染者、健康者、其他疾病（非特定疾病感染者）者。 确定CUT-OFF值的方法一： 标准差比率法预先假定一个cut-off值，然后测定大量的标本，将测定反应如吸光度（OD）值大于此假定cut-off值的弃掉计算余下的测定反应的均值（M1）和标准差（SD1），再将超出M1+5 SD1的测定值弃去；最后计算余下的测定值的均值（M2）和标准差（SD2），以M2+2 SD2作为测定的cut-off值。 确定CUT-OFF值的方法二： 均值2或3个SD法首先测定大量（数千）正常人血清

10、样本，然后将所得到的吸光度均值2或3个SD作为阳性判断值 确定CUT-OFF值的方法三： 综合阴阳性测定值法如测定值为正态分布，则根据u检验，以单侧99.5%的可信限先分别确定阴性和阳性的Cut-off值；如为非正态分布，则百分位数法单侧 95或99来确定Cut-off值。 确定CUT-OFF值的方法四： 综合考虑加转化血清盘法 ROC曲线在Cut-off值设定中的应用 ROC是英文Receiver Operating characteristic的缩写，可直译为接收机工作特性，其最初主要是用于雷达领域。在临床医学检验领域内，ROC不仅可用于不同检验方法之间的比较，而且可用于对检验项目临床准确

11、性的评价以及决定正常和异常的分界点。 ROC曲线描述的是：真阳性率(TPR)（又称灵敏度）=真阳性数/(真阳性+假阴性) 假阳性率(FPR)=假阳性数/(假阳性+真阴性) ； 以FPR为横坐标、TPR为纵坐标所作出来的一条曲线 根据这种关系，可确定区分正常与异常的分界点究竟在何处最为合适，也就是说此时的假阳性和假阴性率最低或比例最为适当或最为符合使用目的。因此，当然就可以用于ELISA测定Cut-off值的确定。但注意血站与临床应用应有所区分，血站应更严格（一般为临床Cut-off值50%）。ROC曲线应用（确定Cut-off值） 定性测定结果的确定定性测定结果确定的依据在于阳性阴性判定值（C

12、ut-off）的建立， Cut-off 值的确立应尽可能地避免假阳性或假阴性结果的出现。除了 Cut-off 值以外，还有许多其它的设值方法以判断阴性和阳性结果，如S/N（常称为P/N）比值（Ratio）等。 CUT-OFF值的不确定性可致假阳性 3. 测定结果的报告酶联免疫吸附试验的报告在理想情况下应达到下述要求（至少）: (1)易于让不熟悉该试验的人所理解; (2)定性测定必须结果明确,即阳性或阴性，在正常范围内或不正常等；（3）数据的可重复性； 结果报告和解释阴性或阳性的概念问题？ 试验解释 临床解释 reactive 有反应性 阳性 nonreactive 无反应性 阴性 临界结果（灰

13、度区）的处理重要的是建立进一步检测的程序： 标本的重复检测 第二份标本的检测 数周或数月后采取样本检测 可能的话，用另一个更敏感特异的 方法（确认试验）检测 确认实验中和试验：如HBsAg检测加HBsAb重组免疫印迹（RIBA）reconbinant immunoblot assay 蛋白印迹（WB） 确认实验(confirmatonry test)特异性应 98-99%可为非免疫学（如培养或核酸检测）或免疫学方法免疫学方法包括蛋白印迹、抗原或抗体封闭阻断试验如果一个检测方法特异性很高或高阳性预示值，则不必进行确认。 结果的报告认真阅读试剂盒说明书，按照其要求报告结果如出现临界结果，应明确是否需对患者进一步追踪观察清楚说明结果对特定疾病诊断意义（可能性高或不可能）和/或需进一步检测。如果已在进行进一步的检测，应在报告中予以说明 结果的解释结果解释的责任属于临床实验室，应根据所检测的人群解释结果。临床解释的责任属于