临床分子生物学检验第六章蛋白质组学技术

1、2022/10/6蛋白质组学技术临床分子生物学检验 第六章2022/10/6 主要内容概述第一节 蛋白质印迹技术第二节 双向凝胶电泳第三节生物质谱技术2022/10/6蛋白质组（proteome）：PROTEins + genOME，意思是Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋白质）概述对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个 或几个蛋白质同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 在空间和时间上动态变化着的整体2022/10/6蛋白质组学(proteomics): 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度

2、分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律.细胞器蛋白质组学：通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白质复合物组成来确定蛋白质在亚细胞结构中的位置。表达蛋白组学：把细胞、组织中的所有蛋白质建立成定量表达图谱或扫描EST图。蛋白质组学包括:2022/10/6蛋白质组学的研究内容1、蛋白质组表达模式（组成）的研究蛋白质组成分鉴定、数据库构建、新型蛋白质的发现、同源蛋白质比较、蛋白质加工修饰分析。2、蛋白质组功能模式（作用）的研究基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析。重要生命活动的分子机制（如细胞周期、分化与发育、环境反应

3、与调节等）。医药靶分子的寻找和分析（包括新药靶分子、肿瘤分子标记、人体病理介导分子等）。2022/10/6Western blot、免疫组化验证蛋白质并确定其定位根据氨基酸序列合成寡核苷酸探针，克隆基因蛋白质功能研究，包括蛋白质生物活性、抗体制备、蛋白质相互作用等方面蛋白质样品电泳前蛋白质样品的处理双向电泳分离 Western blot检测选择目标蛋白斑点，胶内酶切质谱分析（MALDI/TOF或ESI/MS/MS）获得肽质量指纹谱或肽序列标签数据库检索鉴定蛋白质电转印到膜上 图像分析 样品处理蛋白质分离蛋白质鉴定 蛋白质组学研究流程图2022/10/6第一节 蛋白质印迹技术原理：蛋白质经凝胶电

4、泳分离后，在电场作用下将凝胶上的蛋白质条带转移到膜上，经封闭后再用抗待检蛋白质的抗体作为探针与之结合，经洗涤后，再将滤膜与二抗-放射性标记或HRP或AP偶联抗体结合，进一步洗涤后，通过放射自显影或酶反应来确定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置和丰度。2022/10/6Western Blot一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色2022/10/6蛋白质印迹技术的方法特点蛋白质样品的制备SDS电转印靶蛋白的免疫学检测封闭靶蛋白与一抗反应与二抗反应显色2022/10/62022/10/62022/10/6 转膜：负极到正极，依次放海绵，滤纸，凝胶，硝酸

5、纤维膜， 滤纸，海绵 380mA 30分钟 2022/10/6转膜膜的选择尼龙膜硝酸纤维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格便宜特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率（尼龙膜： 480g/cm2 ；硝酸纤维素膜：80g/cm2 ）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度2022/10/6靶蛋白的免疫学检测封闭靶蛋白与一抗反应与二抗反应显色2022/10/6二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法2022/10/6第二节 双向凝胶电泳简介原理和基本流程特点2022/10/6双向电泳简介2-DE是目前唯一种可以仅通过一次

6、操作解析上千种蛋白质的技术 。第一向等点聚焦(IEF)pH梯度载体pI第二向十二烷基硫酸钠(SDS)SDS作为变性剂和助溶剂分子量2022/10/6样品等点聚焦(第一向)双向电泳的基本原理与流程示意分子量pH 梯度(pI)SDS两性电解质pH 9 -pH 3 +聚丙烯酰胺第二向2022/10/61 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）。避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。通过超离心去除所

7、有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。2 最大限度减少样品的损失低温保存样品(一般需低于-86)尽量缩短处理时间除盐，省略不必要的过程保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。样品制备原则2022/10/6样品制备流程溶解预处理(清洗等)破碎沉淀按溶解度分级富集除杂2022/10/6梯度器塑料支持膜固定pH梯度(Immobilized pH Gradient, IPG)胶条的制备ACBFED酸碱 pH 3pH 102022/10/6宽pH梯度及窄pH梯度宽pH梯度用于： 全部蛋白(确定感兴趣蛋白的大致位置)窄pH梯度用于： 提高分辨率 增加载样能力以检测、分析更多蛋白2022/10/6第一向：等点聚

8、焦1. 放置电极垫2. 200 V 维持 1.5h3. 500 V 维持 1.5h 4. 1000 V 梯度上升 1500vh 5. 8000 V 梯度上升 (?) 36000vh时间电压支架盖IPG 胶条电极电极垫2022/10/6 使被分离的蛋白质与SDS完整结合第二向: SDS SDS 平衡 SDSSDS 平衡液50 mM Tris-HCl6 M 尿素30% 丙三醇2% SDS微量 溴酚蓝SDSSDSSDS向电泳缓冲液中加 0.5%的琼脂糖SDS标记纸片IPG 胶条2022/10/6考马斯亮蓝染色灵敏度为30100ng，线性范围是20倍可实现PAGE的无背景染色会对蛋白质进行修饰而影响质

9、谱分析的结果银染可减少胶内蛋白质产量对某些种类的蛋白质染色效果差对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响荧光染料染色包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧光染料灵敏度为210ng其线性范围为3个数量级其他染色凝胶上蛋白质检测2022/10/6凝胶的图像处理分析典型流程凝胶图像的扫描图像加工斑点检测和定量凝胶配比数据分析数据呈递和解释2-DE数据库的建立2-DE 分离的可溶性 E. coli 蛋白2022/10/6双向电泳特点优点：高分辨率缺点：低丰度蛋白质极酸或极碱蛋白质极大或极小的蛋白质难溶蛋白质2022

10、/10/6生物质谱技术2022/10/6质谱分析（mass spectrometry,MS）样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定分子量定性定量质谱m/z离子化2022/10/6基本原理质谱分析法（MS）是指在一定条件下，将样品分子电离成离子，然后通过测定这些离子的质荷比（m/z）和强度来进行定性和定量的一种分析方法质谱分析法的过程为：将样品气化并电离成带电离子，然后通过一定方法将不同m/z的离子分开，并测定其强度，绘出质谱图，对质谱图进行分析可得到关于样品分子结构和定量方面的信息 2022/10/6 完整的现代质谱仪由进样系统、离子源、质量分析器、离子检测器、数据

11、处理及控制系统五部分组成，此外还有一个保持质谱仪高真空度的真空系统。离子源和质量分析器是质谱仪最重要的两个部件，也是不同质谱仪的主要差别所在。电喷雾质谱（ESI）和基质辅助激光解吸谱（MALDI）为离子源的质谱技术已广泛应用于生物大分子研究，是蛋白质组学研究中不可或缺的分析工具，因此被称为生物质谱（BMS） 进样系统离子源质量分析器检测器数据采集及分析真空系统质谱仪模块组成2022/10/6电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱技术是诞生于80年代末期的两项电离技术。这两项技术的出现使传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。具有高灵敏度和高质量检测范围，使得在pmol的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能，并得到迅速的发展。被称做是“软”电离技术，因为： 他们在离子化过程中不会破坏分子结构，能实现分子量大于10,000质量单位的生物大分子的质量分析2022/10/602040608010 0质荷比（m/z)相对强度（）基峰分子离子峰质谱图有机分子受到电子轰击后，会断裂形成不同的