姜黄素抑制多发性骨髓瘤细胞脑源性神经营养因子所诱导的血管新生

1、姜黄素抑制多发性骨髓瘤细胞脑源性神经营养因子所诱导的血管新生【摘要】为了研究姜黄素对多发性骨髓瘤细胞脑源性神经营养因子BDNF、内皮细胞株TrkB的表达及内皮细胞血管新生的影响，以初步讨论姜黄素通过抑制血管新生治疗多发性骨髓瘤的可能性，采用RT-PR法分别检测姜黄素处理前后多发性骨髓瘤细胞株K3中BDNF的基因表达变化与内皮细胞株EV304中TrkB的基因表达变化，应用内皮细胞迁移试验和内皮细胞小管形成试验评价姜黄素对内皮细胞血管新生的影响。结果显示：外源性BDNF可以有效地促进内皮细胞的迁移和小管形成，但这两个效应均能被姜黄素明显阻断；K3细胞表达BDNFRNA，EV304细胞表达TrkBR

2、NA，姜黄素对两者的表达均具有抑制作用，并呈剂量-时间依赖性。结论：BDNF是一种具有促进血管增殖活性的细胞因子，姜黄素可以分别下调细胞BDNF与内皮细胞TrkB的表达，阻碍两者间的互相作用，继而抑制血管新生，这可能成为治疗潜在的作用靶点。【关键词】姜黄素InhibitryEffetfuruinnAngigenesisInduedbyBrainDerivedNeurtrphiFatrfrultipleyelaellsAbstratInrdertexplretheprbabilityfuruintreatingultipleyela()viatheinhibitinfangigenesis，th

3、eexpressinsfbrainderivedneurtrphifatr(BDNF)anditsspeifireeptrinhuanellsandendthelialellseredetetedbyreversetransriptase-plyerasehainreatin(RT-PR).Theangigeniativityasevaluatedbyendthelialelligratinassayandtubulefratinassayinvitr.TheresultsshedthatexgenusBDNFsignifiantlyinduedendthelialelltubulefrati

4、nandendthelialelligratin，theseteffetsereinhibitedbyuruin.Furtherre，BDNFasdetetedintheellandTrkBasdetetedintheendthelialellanduruindepressedtheRNAexpressinfBDNFandTrkBinthedse-andtie-dependentanners.ItisnludedthatBDNFisanvelangigenesisprtEin.uruininterruptstheinteratinbeteenultipleyelaellsandendtheli

5、alellsbyreduingTrkBexpressininendthelialellsandinhibitingBDNFprdutininultipleyelaells，eventually，resultingininhibitinfangigenesis.Thisisprbablynepartftheehanisftheuruintreatingviatheinhibitinfangigenesis.Keyrdsuruin；brainderivedneurtrphifatr；ultipleyela；angigenesis血管新生在多发性骨髓瘤ultipleyela，的发生与开展中占有重要的

6、地位，我们近期的研究结果说明，患者高表达脑源性神经营养因子brainderivedneurtrphifatr，BDNF，且BDNF具有促进血管增殖活性1，2。在本试验中我们检测了姜黄素对BDNF体外诱导的内皮细胞血管新生的影响及细胞、内皮细胞中BDNF和TrkB转录程度的改变，以初步讨论姜黄素通过抑制血管新生途径治疗的可能机制。材料和方法细胞株及其培养人多发性骨髓瘤细胞株K3由上海长征医院候健教授惠赠，内皮细胞株EV304购于武汉大学典型物种保藏中心。将K3和EV304分别置于含10%胎牛血清的RPI1640和DE培养液Gibl中，在37、52及饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期的细胞进展实

7、验。主要试剂姜黄素Siga公司，以二甲亚砜(DS)配成8l/L储存液，使用前用无菌的PBS稀释至工作浓度。BDNFRDsyste用含1%牛血清白蛋白的PBS溶解至50g/l，储存于-20；使用时终浓度为100ng/l。去生长因子基质胶atrigel为BetnDikinsn公司产品。引物由上海生工公司合成引物序列及扩增片段大小见表1，-LV逆转录酶、lig(15dt)为prega公司产品，RNasin、Taq酶为Bistar公司产品，dNTP为BI公司产品。Table1.Sequenefpriersandsizefaplifiedfragents略内皮细胞迁移试验参考早期文献3报道，于12孔细胞

8、培养板每孔接种1105EV304细胞。单层培养至细胞覆盖率为90左右时，换1%FBS的DE培养12小时，使细胞同步化。用橡胶刮片在孔内刮出两条整齐而平行的205刮痕，弃上清，参加新颖含1血清的培养液1l并在不同孔内参加实验相应空白对照PBS、阳性对照BDNF和试验组BDNF不同浓度的姜黄素。37、52下培养24小时。4多聚甲醛固定，瑞氏-姬姆萨染色后光学显微镜下100观察刮痕。每孔随机选择5个视野，进展迁移细胞计数，每组重复3次。内皮细胞小管形成试验参考早期文献4报道，EV304在含1血清的DE培养液中培养12小时后收获。于24孔细胞培养板每孔参加250latrigel，37，52下温育90分

9、钟使胶凝固。每孔参加EV304制成的5105/l不含血清的细胞悬液400l，并添加实验所需的空白对照PBS、阳性对照BDNF和试验组BDNF不同浓度的姜黄素。37，52下培养，24小时后光学显微镜下100观察细胞管状排列及管状构造数量、完好程度。逆转录PRRT-PR检测BDNF的和TrkB的RNA细胞总RNA的提取采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法提取K3与EV304的总RNA，用DNA/RNA紫外检测仪测定其含量及纯度。逆转录取总RNA9l，参加-LV逆转录酶1l，5Rtbuffer4l，lig(dt)1l，RNasin0.5l，dNTP4l，用DEP处理过的双蒸水补充至20l。42水浴1小时

10、，955分钟灭活-LV逆转录酶，-20保存或即用。PR扩增取1gDNA，加Taq酶0.5l，10buffer5l，dNTP2l，BDNF、TrkB或-atin上下游引物各2l，用DEP处理过的双蒸水补充至50l，上机检测。BDNF与TrkB扩增条件分别为:95预变性4分钟，95变性60秒，55退火30秒，72延伸60秒，共30个循环；94预变性4分钟，94变性30秒，65退火30秒，72延伸60秒，共32个循环。电泳取PR产物4l于1.5%琼脂糖凝胶上电泳15分钟，紫外光显影。统计学分析应用SPSS11.5软件进展统计学分析，实验结果以xSD表示，组间分析采用两独立样本的t检验。结果姜黄素阻断

11、BDNF诱导的内皮细胞迁移效应在未作任何处理的情况下，内皮细胞具有一定的迁移才能，100ng/l的BDNF能明显促进其迁移，每个视野的迁移细胞总数明显地增加。姜黄素阻断BDNF诱导的迁移效应，迁移细胞总数随着姜黄素浓度的升高而下降，20l/L时几乎无细胞挪动，30l/L时贴壁的细胞局部开场脱落，细胞皱缩凋亡，40l/L时绝大多数细胞脱落、皱缩凋亡图1。BDNF组与对照组之间、姜黄素组10，20l/L与BDNF组相比，迁移细胞总数具有显著差异P0.01表2。Table2.Nuberfigratedellsindifferentgrups略姜黄素阻断BDNF诱导的内皮细胞小管形成效应BDNF诱导内

12、皮细胞在atrigel上形成小管状构造，管壁完好，管腔大。姜黄素具有抑制BDNF诱导的小管形成效应的才能，并随浓度的增加而增强。30l/L时几乎无管状构造形成，局部细胞皱缩凋亡，40l/L时细胞聚集成团，贴壁困难图2。BDNF组与对照组之间、姜黄素组10，20，30l/L与BDNF组相比，小管总面积具有显著差异P0.01表3。Table3.Ttalareaffredtubulespervisualfieldindifferentgrups略姜黄素对K3细胞BDNF表达的影响用0、10、20、30、40l/L的姜黄素孵育K3细胞24小时，以0.5%的DS作为对照，排除DS对K3的影响。结果显示，

13、随着浓度的增加K3细胞表达的BDNFRNA逐渐减少，40l/L时已检测不到BDNFRNA的表达图3。以20l/L的姜黄素分别孵育K3细胞12、24、36、48小时，随着时间的增加K3细胞表达的BDNFRNA逐渐减少，作用48小时后K3细胞无BDNFRNA表达图4。姜黄素对EV304细胞TrkB表达的影响用0、10、20、30、40l/L的姜黄素孵育EV304细胞24小时，以0.5%的DS作为对照，排除DS对EV304的影响。结果说明，随着浓度的增加EV304细胞表达的TrkBRNA逐渐减少，在姜黄素浓度为30l/L时已检测不到TrkBRNA的表达图5。以20l/L的姜黄素分别孵育EV304细胞

14、12、24、36、48小时，结果随着时间的增加EV304细胞表达的TrkBRNA逐渐减少，作用36小时后EV304细胞无TrkBRNA表达图6。讨论姜黄素是从草本植物姜黄的根茎中提取出来的一种酚类色素，其抗癌作用倍受瞩目，它主要通过抑制肿瘤细胞的增殖、调控癌基因和抑癌基因的表达、诱导细胞周期停滞和细胞凋亡等机制发挥抗肿瘤效应5，6。近年来国外学者将姜黄素的研究延伸到防治中。Alk等7，8证实，姜黄素下调NF-B及由NF-B调节的基因产物IB、Bl-2、Bl-xl、yleD1和IL-6，将细胞周期阻滞于G1/S，继而抑制细胞系的增殖；从患者骨髓中别离的D138+细胞常规表达活化形式的NF-B和S

15、TAT3，姜黄素能抑制这些转录因子的活性、削弱细胞分泌细胞因子和黏附于骨髓基质细胞的才能。血管新生在的发生开展中占重要地位，以抑制血管新生为目的的治疗已成为难治性/复发性的重要着眼点。有研究说明姜黄素具有抗血管新生的活性9，10，Passs等11在对激光诱导的脉络膜血管新生大鼠动物模型的研究中发现，膜内注射姜黄素能有效抑制脉络膜的血管新生。Thalr等9的试验说明，姜黄素可以抑制内皮细胞小管形成，在内皮细胞形态发生过程中充当血管新生阻滞剂的角色。然而，姜黄素是否能抑制的血管新生，在国内外尚无人研究。内皮细胞迁移试验和小管形成试验是评价体外内皮细胞血管形成才能的两种重要指标。在本实验中100ng

16、/l的BDNF可以有效地促进内皮细胞的迁移和小管形成，而姜黄素可明显阻断BDNF诱导的这一血管新生效应，并呈剂量依赖性。另外，我们以往的研究结果证实，BDNF是一种具有促进血管新生活性的细胞因子，且与有着亲密的联络，高表达于患者外周血血浆中，其升高趋势与VEGF的升高趋势具有相关性1，2。因此推测姜黄素可能会通过抑制BDNF诱导的血管新生而起到治疗的作用。通过阻断血管新生的方法来防治肿瘤的关键在于下调血管新生因子，阻断肿瘤细胞与内皮细胞间的互相作用，继而抑制血管新生。Pllann等12指出，姜黄素通过下调HL-60与HeLa细胞-jun蛋白的表达，减少大约75%VEGF蛋白的分泌，到达抗肿瘤、

17、抗血管新生的效应。本实验数据显示，在细胞和内皮细胞中，在转录程度上能分别检测到BDNF及其特异性的受体TrkB的表达，而姜黄素能同时阻断两种细胞中目的产物的表达，两者均呈时间-剂量依赖性。众所周知，肿瘤细胞分泌的细胞因子与内皮细胞膜上的特异性受体结合是血管新生的始动因素，姜黄素同时下调两种细胞BDNF和TrkB表达，必然阻碍了细胞和内皮细胞通过BDNF介导的生物信息的传递。综上所述，BDNF是一种具有促进血管增殖活性的细胞因子，姜黄素可以分别下调细胞BDNF与内皮细胞TrkB的表达，阻碍两者间的互相作用，从而抑制血管新生，这可能成为治疗潜在的作用靶点。【参考文献】1王雅丹，胡豫，魏文宁等.脑源

18、性神经营养因子在多发性骨髓瘤患者血浆中的表达.临床血液学杂志，2022；17:82-862胡豫，孙春艳，王雅丹等.脑源性神经营养因子BDNF在多发性骨髓瘤患者血浆中的表达增高及其意义的初步研究.中国实验血液学杂志，2022；13:104-1093SharaGD，HeJ，BazanHE.p38andERK1/2rdinateellularigratinandprliferatininepithelialundhealing:evidenefrss-talkativatinbeteenAPkinaseasades.JBilhe，2022；278:21989-219974YahataY，Shirak

19、ataY，TkuaruS，etal.NuleartranslatinfphsphrylatedSTAT3Isessentialfrvasularendthelialgrthfatr-induedhuanderalirvasularendthelialelligratinandtubefratin.JBilhe，2022；278:40026-400315陈伟红，陈燕，谷俊侠等.姜黄素对K562细胞STAT5信号分子的影响.中华血液学杂志，2022；25：151-1536吴裕丹，陈燕，何静等.姜黄素在急性髓性白血病HL-60细胞中对凋亡调控蛋白Bax、Bak、l-1的影响.同济医科大学学报，2001；30：25-277BhartiA，DnatN，SinghS，etal.uruin(diferulylethane)dn-regulatesthenstitutiveativatinfnulearfatr-BandIBkinaseinhuanultipleyelaells，leadingtsuppressinfprliferatinandindutinfapptsis.Bld，2022；101:1053-10628BhartiA，ShishdiaS，ReubenJ，etal.Nul