基因工程-7章 PCR技术及其应用课件

1、2022/10/51第七章 PCR技术及其应用一、PCR技术原理二、PCR技术应用2022/10/52PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长一、 PCR技术原理2022/10/53PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶

2、RNA引物RNA引物2022/10/54PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGACCTACC3DNA聚合酶DNA聚合酶2022/10/55PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链式反应的发明2022/10/57PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等

3、人发明了聚合酶链反应。基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制。最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行2022/10/58DNA polermases for PCR:Thermus aquaticus古细菌-水生栖热菌最适生长温度70，具有5 3聚合酶活性和5 3外切酶活性2022/10/510引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2022/10/511729455PCR循环2022/10/512PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明耐热DNA

4、聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。2022/10/514PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95)2022/10/515Target SequenceTarget SequencePCR原理示意图模板DNA的变性：模板DNA经加热至93-95左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,

5、以便它与引物结合,为下轮反应作准备；PCR Cycle - Step 3 - At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated2022/10/517Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。End

6、 of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence2022/10/518Target SequenceTarget Sequence每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。2022/10/519被扩增的DNA片段模板 DNA 变性引物与模板退火引物延伸模板DNA变性引物与模板退火引物延伸引物延伸循环1循环2循环3模板 DNA 变性引物与模板退火21222423825次循环后，被扩增的DNA片段的拷贝数为 225 附图Target AmplificationTarget Amplificat

7、ion2022/10/520No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon2022/10/521PCR反应体系缓冲溶液(Mg2+是DNA聚合酶的激活剂) 耐热DNA聚合酶脱氧核糖三磷酸核苷酸

8、(dNTPs)模板DNA上游引物、下游引物2022/10/522（1）PCR反应缓冲液Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2022/10/524（3）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等,一般为50-200mol/L 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。

9、2022/10/525（4）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR引物的设计一般原则引物长度一般以1530bp为宜,过短则降低特异性，过长则会引起引物间退火而影响有效扩增。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。G/C和A/T碱基均匀分布， G/C含量在4555%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。2022/10/527要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以及同一引物自身3末端碱

10、基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引发效率较高。引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。2022/10/5282022/10/529例 1. 引物的 3 末端形成杂交 5 GGCTATACCGATTCGAATCA 3 3 ACTAAGCTTAGCCATATCGG 5例 2. 引物的 5 末端形成杂交 5 ATCGATCGATGGCATGGTAT 3 3

11、 TATGGTACGGTAGCTAGCTA 5例 3. 引物的中间部分形成杂交 5 AACGAGCTTCGAAGGCTAA 3 3 AACGAGCTTCGATGGCTAA 5例 4. 5 CCAGAGGGAGAACTCCCTCGC 3引物设计软件：Primer 2, Primer 3, Oligo2022/10/5302022/10/5312022/10/532PCR一般循环参数变性 使双链DNA解链为单链,95 35分钟(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定, 适宜的退火温度大约低于引物Tm值45-55 ，介于45-55 。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵

12、敏性。2022/10/533（3）延伸 72，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加标准的PCR反应条件：10缓冲液 10 L4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12gTaq DNA聚合酶 2.5UMg2+ 1.5mmol/L2022/10/5342022/10/535PCR仪2022/10/536模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022/10/53750引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特

13、点2022/10/538引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022/10/53972第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022/10/540955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022/10/54172第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022/10/542重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+

14、x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 附图PCR反应注意的事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照： 阳性模板阴性对照： 阴性模板试剂对照： 除模板外的所有组分2022/10/543PCR反应的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，24 h完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA2022/10/54

15、41、反转录PCR(RT-PCR) 2、反向PCR3、复合PCR4、不对称PCR 5、嵌套PCR6、实时定量PCR2022/10/545 PCR技术的主要类型 1、反转录PCR(RT-PCR) 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5和3末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。2022/10/5462022/10/547反转录酶具有依赖于RNA的DNA聚合酶活性，即5 3的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有35和53的RNA外切核

16、酸酶活性。AMV和MLV。双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链2022/10/5482022/10/54953AAAAA535335533553RT-PCR 原理mRNA1st cDNA反转录酶、下游引物、dNTPsTaq DNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs5533特异 PCR 产物5533经 30 个循环，产生 230 个分子拷贝55332022/10/550MLV RT催化的 cDNA合成2022/10/5512、反向PCR (reverse PCR) 是用反向引物对某个已知DNA片段两侧未知序列进行的PCR。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知

17、部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA。已知序列未知序列未知序列2022/10/552已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶2022/10/5533、复合PCR(或称多重PCR)在一个反应体系加入多对不同的PCR引物同时扩增，获得多个PCR产物，这种PCR称为复合PCR。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物2022/10/5544、不对称PCR 是指用不等量的一对引物产生大量单链DNA的PCR。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组

18、DNA结构功能的研究2022/10/555 高浓度引物低浓度引物5、嵌套PCR(或称巢式PCR)是指先后用两套引物进行扩增的PCR。用第一套引物扩增1530个循环；再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增1530个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增。2022/10/5566、实时荧光定量PCR(real-time PCR):美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。通过特定设计的PCR仪器检测PCR扩增过程每一轮循环产物标记的荧光信号累积数量，从而进行实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,称为实时荧光定量PCR。2022/10

19、/5572022/10/558TaqMan Probes 发射基团荧光淬灭基团53该探针可与扩增序列内的DNA模板发生特异性杂交,探针的5端标以荧光发射基团,靠近3端标以荧光淬灭基团,探针3端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。实时荧光定量PCR原理工作原理是利用Taq酶的53外切酶活性。在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针，它与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交。探针的5端标记荧光发射基团(荧光发射峰值在518nm处)，3端标记荧光淬灭基团 (荧光发射峰值在582nm处)且被磷酸化，以防止探针3端在PCR扩增过程中被延伸。2022/10/559当探针保持完整时，淬灭基团抑制发

20、射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当Taq酶移动到探针切断,淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。2022/10/5602022/10/561 实时PCR技术原理2022/10/562 特 点FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程

21、中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。2022/10/5632022/10/564 PCR技术应用1. 基础研究基因或 cDNA 克隆：从基因数据库中获得某一基因或 cDNA 核苷酸序列,用 PCR 方法扩增并克隆该基因或 cDNA。基因表达：用 RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。2. 医学感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核杆菌、乙肝病毒等。遗传病相关基因检测：镰刀型细胞贫血、血友病。恶性肿

22、瘤的诊断。2022/10/5653. 法医学中的基因和亲子鉴定4. 考古学中生物种类间的亲缘关系、进化途径判定5. 基因动、植物的检测转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。转基因植物的检测：玉米、大豆等。本章重点掌握的内容概念：RT-PCR、复合PCR、反向PCR、不对称PCR、嵌套PCR、实时荧光定量PCRPCR技术的基本原理PCR引物设计的一般原则实时荧光定量PCR技术的基本原理2022/10/5662022/10/5671、要求将下面基因片段克隆至表达载体pET-28相应位点上，并获得此基因的表达。 ATG GGT CGG GAT CCT GAT ACA GAT AAT AAT T

23、TC TCA AAG GAC CAT GGT TGG TAT TTA GCT TAT TCT ATA CCT GAC ACA GGG GAA TCA CAA ATA AGA AAA TTT TCA GCA TTA GCT AGA TAT GAA TGG CAA AGA GGA AAC TAT AAA CAA GCT ACA TTC TAT CTT GGA GAG GCT ATG CAC TAT TTT GGA GAT ATA GAT ACT CCA TAT CAT CAA GCT TAT GTT ACT GCC GTT GAT AGC GCA GGA CAT GTT AAG TTT GAG ACT TTT GCA GAG GAA AGA AAA GAA CAG TAT AAA ATA AAC ACA GCA GGT TGC AAA ACT AAT GAG GCT TTT TAT ACT GAT ATC TTA AAA AAC AAA GAT TTT AAT GCA TGG TCA AAA GAA TAT GCA AGA GGT TTT GCT A