人源抗HER2单链抗体轻链恒定区鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构

1、人源抗HER2单链抗体/轻链恒定区/鱼精卵白截短体交融卵白的基因构王凯，温伟红，王涛，张瑞，秦炜炜，雷小英，杨安钢【关键词】HER2；,单链抗体；,鱼精卵白nstrutinandexpressinfhuanantiHER2SFv/k/tPfusinprtEininE.liandidentifiatinfitsativity【Keyrds】HER2;singlehainantibdy;prtaine【摘要】目的：构建人抗HER2单链抗体(SFv)/人轻链恒定区k/鱼精卵白截短体(tP)交融卵白基因，在大肠杆菌中表达、纯化并阐发该交融卵白的活性.要领：方案引物扩增人抗HER2单链抗体e23sFv基

2、因和轻链恒定区编码序列(k)，毗连成SFv/k片断，人工合成tP序列，毗连于SFv/k末了，构建成SFv/k/tP交融基因，将其克隆入原核表达载体pET32a后，在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表达，表达产物经SDSPAGE和esternBlt断定后，用NiNTA螯合层析介质纯化.细胞ELISA阐发SFv/k/tP交融卵白抗原亲合活性，凝胶迁徙实行检测SFv/k/tP交融卵白与DNA的结合活性.效果：乐成构建了人抗HER2SFv/k/tP交融基因，经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了可溶性表达.表达的SFv/k/tP交融卵白保持了与抗原的结合活性，同时具有结合DNA的本领.结论：SFv

3、与k，tP交融后，同时具有抗原和DNA结合活性，为该SFv用于HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗奠基了底子.【关键词】HER2；单链抗体；鱼精卵白0弁言HER2是癌基因erbB2/neu的表达产物，在乳腺癌、卵巢癌等多种人类肿瘤细胞中高度表达，是如今公认的肿瘤细胞外貌的特异性标识表记标帜分子1-2.单链抗体(singlehainvariablefragent，SFv)和亲代抗体比拟，具有分子孝穿透力强、免疫原性低的特点，日益成为诊断和治疗的精良导向载体3-4.鱼精卵白是一种碱性卵白，能与核酸结合5.鱼精卵白截短体(trunatedprtaine，tP)是一段长22个氨基酸的短肽，它保存了富含碱性氨

4、基酸的序列，同样具有核酸结合成效.我们将抗HER2SFv基因和tP编码序列交融，同时为了制止SFv和tP之间空间布局的彼此影响，在其间插入了一段轻链恒定区编码序列kappalighthainnstantregin,k，以期得到同时具有抗原和核酸结合活性的SFv/k/tP交融卵白，核酸与该交融卵白结合后，在其引导下，有望实现核酸的靶向运送，旨在为该SFv在HER2阳性肿瘤的靶向基因治疗的应用中奠基底子.1质料和要领1.1质料质粒pVe23sFvPEIIGrBa6，pb3HFab15，pU19，pET32a；大肠杆菌DH5，BL21(DE3)LysS和HER2阳性的人胃癌细胞系SG7901第四军医

5、大门生物化学与分子生物学教研室；限定性内切酶、毗连酶日本TaKaRa公司；IPTG美国Prega公司；质粒小量提取试剂盒、胶接纳试剂盒合胖优晶生物技能；HiTrapNiNTA螯合层析介质(美国Invitrgen公司)；6HisAb德国Qiagen公司；HRP羊抗鼠IgG武汉博士德生物；EL化学发光试剂盒，BA卵白定量试剂盒美国Piere公司；RPI1640造就基美国Gib公司；尺度胎牛血清中国医学科学院生物工程研究所.1.2要领方案扩增SFv基因的引物S5：5tttgaattgagtagtgaagtt3，S3：5ttttgagggagaggtgagtggt3，在两头引物中别离引入ERI和XhI

6、酶切位点下划线部门.扩增k序列的引物k5：5ttttgagatgtggtgaattgt3，k3：5tttttagataaatttgttga3，在两头引物中别离引入XhI和XbaI酶切位点下划线部门.tP编码序列寡核苷酸合成tP1：5tagagagagagggagagatattagagagaaaagaagtgagagaaggaggggagg3，tP2：5tggtggttggtgttataatggggtttgtttttaggttgtttgtgggg3，寡核苷酸链的两头带有XbaI和NtI酶切位点的粘端序列下划线部门，可以或许直接与经XbaI和NtI酶切的载体毗连.引物和寡核苷酸由北京奥科生物技能合

7、成.别离以pVe23sFvPEIIGrBa和pb3HFab15质粒为模板，S5，S3和k5，k3为引物PR扩增SFv和k片断，产物经相应的酶切后，一起克隆入pU19质粒，并举行序列测定，测序准确后的质粒定名为pU19SFv/k.将合成的两条tP编码序列寡核苷酸链迟钝退火后，与从pU19SFv/k质粒用ERI和XbaI切下的SFv/k片断一起毗连入经ERI和NtI双酶切的pET32a载体，转化大肠杆菌DH5后，挑选阳性克隆，酶切断定，对酶切断定准确的克隆交由北京奥科生物技能测序，将测序准确的质粒定名为pET32aSFv/k/tP.将断定准确的重组质粒pET32aSFv/k/tP转化大肠杆菌BL2

8、1，挑取单克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB造就基中，37留宿造就，越日以1100接种，37造就至A600n达0.6摆布，参加IPTG终浓度为0.5l/L，诱导造就3h，取5L未诱导及诱导菌液离心网络菌体，以100l/LTrisHl(pH8.0)重悬，超声裂菌后离心，取少量上清参加等量2SDS上样缓冲液，沉淀重悬于适量1SDS上样缓冲液，煮沸5in,离心后取上清举行SDSPAGE阐发，凝胶薄层扫描阐发卵白表达环境.同时对表达产物举行esternBlt断定，卵白样品经SDSPAGE分散后电转移至硝酸纤维素膜，以5g/L脱脂奶粉室温关闭1h，依次参加鼠抗6HisAb11000稀释，4孵育留宿，HRP

9、标识表记标帜的山羊抗小鼠IgG(15000稀释，室温1h)，用化学发光试剂盒于暗室条件下X光片感光显影.取200L诱导菌离心后网络菌体，用100l/LTrisHl(pH8.0)重悬，冰浴中暖和超声6次每次2in，隔断10s破裂菌体，4，10000g离心5in，网络上清过0.45滤膜，用镍次氨基三乙酸(Ni2+NTA)螯合层析介质室温结合1h，用洗涤缓冲液100l/LTrisHl，20l/L咪唑，pH8.0洗涤5次后，别离用含100，200，500l/L的咪唑洗脱缓冲液洗脱.各取少量差异组洗脱液参加等量2SDSLadingBuffer，煮沸5in,离心后取上清举行SDSPAGE阐发.接纳细胞EL

10、ISA的要领.胰酶消化生长铺满的SG7901细胞，重悬于含100L/L胎牛血清的RPI1640造就液，调解细胞密度为5108/L，以100L/孔参加96孔细胞造就板，37，50L/L2造就箱中造就24h，细胞充实贴壁生长.40g/L多聚甲醛结实10in，PBS洗3次.每孔参加100L含30L/LH22PBS，室温反响20in，PBS洗3次.在细胞包被孔中别离参加差异稀释度的卵白样品，每孔100L，设复孔，阴性比拟，37孵育1h，依次参加鼠抗6HisAb(11000稀释)，HRP标识表记标帜的山羊抗小鼠IgG15000稀释孵育，TB显色，停顿反响后测定各孔A450n值.接纳凝胶迁徙停滞实行.将1

11、g质粒DNA别离与差异量的SFv/k/tP交融卵白于0.2l/LNal溶液中室温孵育30in，10g/L琼脂糖凝胶电泳分散，不雅察效果.2效果2.1重组表达载体的构建及断定PR别离扩增出长度为720bp的抗HER2SFv基因片断(图1A)和长度为330bp的k片断(图1B)，与预期长度同等，克隆入pU19载体后，经测序证明序列与方案序列完全符合.用ERI和XbaI切下SFv/k片断后，与合成的tP寡核苷酸退火产物一同毗连入经ERI和NtI双酶切的pET32a载体，重组质粒经ERI和NtI双酶切后，出现长度为1130bp摆布的片断(图1)，与预期的SFv/k/tP片断长度同等，经测序证明序列与方

12、案序列完全符合，表白重组原核表达质粒构建乐成.2.2SFv/k/tP交融卵白的诱导表达及断定2.3SFv/k/tP交融卵白的纯化SDSPAGE表现SFv/k/tP交融卵白得到有用纯化，经薄层扫描阐发纯度别离到达90%以上(图3).用BA法测定纯化卵白的均匀浓度别离为400g/L.2.4SFv/k/tP交融卵白的抗原结合活性检测细胞ELISA检测效果表现：随着稀释度的增长，SFv/k/tP交融卵白与抗原的结合削弱，提示表达的交融卵白能与SG7901细胞外貌的HER2抗原特异性结合，而且与SFv比拟，SFv/k/tP交融卵白的结合活性无显着差异，说明k，tP的交融对SFv的结合活性没有明显影响图4

13、.2.5SFv/k/tP交融卵白的DNA结合活性检测凝胶迁徙停滞实行效果表现：SFv/k/tP交融卵白与质粒DNA作用后，可以使DNA的迁徙速率变慢，而且SFv/k/tP交融卵白含量越高，DNA的迁徙速率越慢，提示该交融卵白可以或许与DNA结合图5.3讨论HER2分子是与肿瘤生长、侵袭、转移有关的紧张分子，在多种肿瘤中高度表达且与患者预后严密相干，是如今公认的肿瘤细胞外貌的特异性标识表记标帜分子1-2.研究证明，以HER2分子为靶点的导向生物治疗，可以或许按捺多种肿瘤恶性表型，对肿瘤举行有用操纵7.完备抗体分子因其较强的免疫原性和较弱的构造穿透性，临床应用受到限定.SFv将抗体重链可变区和轻链

14、可变区通过一段柔性短肽毗连起来，由于只保存了V区，免疫原性大大低落，同时由于没有F段，不克不及与非靶细胞的F受体结合，淘汰了抗体的非特异性结合而更会合到达特定部位，因此成为导向药物的抱负载体3-4.SFv可与其他效应分子交融构建成多种具有双重成效的分子，最常见的如免疫毒素、双特异抗体、放射性同位素标识表记标帜的SFv等8.如今，部门SFv及其衍生物已进入临床I，II期试验阶段9.鱼精卵白最初创造于精子细胞，它可以或许将基因组DNA会合在精子的头部，包管遗传信息的通报4.tP也可以或许与DNA结合，这与它所具有的碱性氨基酸序列有关5.我们将抗HER2SFv与tP交融，同时为了制止两个布局域之间空

15、间布局的彼此影响，又在两个基因之间插入了一段k，以期得到既有抗原结合活性，又同时具有DNA结合活性的SFv/k/tP交融卵白，DNA与SFv/k/tP交融卵白结合后可以在SFv引导下到达特定构造，并在特定构造内表达，不但可以低落免疫原性，还可直接在体内得到有活性的卵白，将更有利于进一步应用10.如今，单链抗体表达重要的宿主体系为大肠杆菌，由于大肠杆菌遗传配景明晰、造就操纵简朴、本钱低廉，加之小分子抗体不存在F段糖基化修饰题目，故较得当小分子抗体的表达.我们将重组的pET32aSFv/k/tP表达载体转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后SFv/k/tP交融卵白以可溶性表达为主，表达量占上清卵白

16、的40%以上，使用载体pET32a上的6His交融标签，我们接纳Ni2+NTA螯合层析介质乐成的从表达菌裂解上清中纯化出了高纯度的交融卵白.和SFv比拟，SFv/k/tP交融卵白与HER2抗原的亲合活性没有明显差异，同时具有DNA结合活性，为该SFv用于靶向运送DNA或siRNA的研究奠基了底子.【参考文献】1KuarR,YarandBagheriR.TherlefHER2inangigenesisJ.Seinnl,2001,28(5Suppl16):27-32.2BaxevanisN,StirpuluPA,StiriaduNN,etal.IunbilgyfHER2/neunprtEinand

17、itsptentialappliatininaneriuntherapyJ.anerIunlIunther，2022,53(3):166-175.3Suzuki,TakayanagiA,ShiizuN.TargetedgenedeliveryusinghuanizedsinglehainantibdyithnegativelyhargedligpeptidetailJ.anerSi,2022,95(5):424-429.4Junghans,KreuterJ,ZierA.AntisensedeliveryusingprtainelignuletidepartilesJ.NuleiAidRes，2

18、000，28(10):45.5LiX,StukertP,BshI,etal.SinglehainantibdyediatedgenedeliveryintErbB2psitivehuanbreastanerellsJ.anerGeneTher,2001,8(8):555-565.6ZhaJ,ZhangLH,JiaLT,etal.Seretedantibdy/granzyeBfusinprteinstiulatesseletivekillingfHER2verexpressingturellsJ.JBilhe，2022,279(20):21343-21348.7arterP,PrestaL,Gran,etal.HuanizatinfanantiP185HER2antibdyfrhuananertherapyJ.PrNatlAadSiUSA,1992,89(2):4285-4289.8StkinLH,HlesS.Therlefther