生物制药文件

1、304/304韶关学院20122013学年第二学期期末考试试卷 生物技术制药（A卷）订订一名词解析 1、蛋白质药物化学修饰：凡是通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质药物分子的共价结构发生改变，都可称为蛋白质药物的化学修饰。有的情况下化学结构的改变并不阻碍蛋白质的生物学活性(称非必需部分的修饰)；但大多情况下将导致生物活性的改变甚至丧失。线2、固定化酶：不溶于水的酶。是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于操纵，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。线3、亚单位疫苗：利用微

2、生物的某种表面结构成分（抗原）制成不含有核酸、能诱发机体产生抗体的疫苗。4、人-鼠嵌合抗体：嵌合抗体是最早制备成功的基因工程抗体。它是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。5、生物技术制药：生物技术制药是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。二单选1、酶的要紧来源是 A、生物体中分离纯化 B、化学合成 C、微生物生产 D、动/植

3、物细胞与组织培养2、所谓“第三代生物技术”是指 A、海洋生物技术 B、细胞融合技术 C、单克隆技术 D、干细胞技术3、菌体生长所需能量与菌体有氧代谢所能提供的能量在什么情况下，菌体往往会产生代谢副产物乙酸：A、大于 B、等于 C、小于 D、无关4、促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为：A、人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用B、人促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定C、大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活D、人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感 E、大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化5

4、、目前基因治疗最常用的载体是： A、腺病毒 B、反转录病毒 C、腺相关病毒 D、痘苗病毒 E、疱疹病毒6、cDNA第一链合成所需的引物是： A、Poly A B、Poly C C、Poly G D、Poly T E、发夹结构7、为了减轻工程菌的代谢负荷，提高外源基因的表达水平，能够采取的措施有：A将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个时期B、在宿主细胞快速生长的同时诱导基因表达C、当宿主细胞快速生长时抑制重组质粒的表达D、当宿主细胞快速生长时诱导重组质粒的复制8、基因工程制药在选择基因表达系统时，首先应考虑的是：A、表达产物的功能 B、表达产物的产量C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的

5、难易9、基因工程药物的化学本质属于： A.糖类 B.脂类 C.蛋白质和多肽类 D.氨基酸类10、用聚二乙醇（PEG）诱导细胞融合时，下列错误的是： A、PEG的相对分子量大，促进融合率高 B、PEG的浓度高，促进融合率高 C、PEG的相对分子量小，促进融合率高 D、PEG的最佳相对分子量为400011、以大肠杆菌为目的基因的表达体系，下列正确的是： A、表达产物为糖基化蛋白质 B、表达产物存在的部位是在菌体内 C、容易培养，产物提纯简单D、表达产物为天然产物12、人类第一个基因工程药物是： A、人胰岛素 B、重组链激酶 C、促红细胞生成素 D、乙型肝炎疫苗13、下列不属于加工改造后的抗体是：

6、A、人-鼠嵌合抗体 B、单链抗体C、鼠源性单克隆抗体 D、单域抗体14、动物细胞培养的条件中，不正确的是： A.最适pH为7.2-7.4 B.最适温度为370.50C C.最理想的渗透压为290-300mOsm/kg D.氧浓度为100%15、第三代抗体是指：A、B淋巴细胞合成和分泌的球蛋白B、多发性骨髓瘤细胞产生的免疫球蛋白 C、融合细胞产生的单克隆抗体D、利用基因工程技术制备的基因工程抗体16、现代生物技术的标志是：A、DNA互补双螺旋结构模型的提出B、DNA测序技术的诞生C、第一只克隆羊“多莉”的诞生D、人类基因组草图的完成17、获得目的基因最常用的方法是：A、化学合成法 B、PCR技术

7、 C、逆转录法 D、DNA探针技术18、所谓“第二代基因工程”是指A、蛋白质工程 B、细胞工程 C、酶工程 D、抗体工程19、酶和细胞固定化最常用、最有效的方法是：A、载体结合法 B、交联法C、包埋法 D、选择性热变性法20、真核基因在大肠杆菌中以融合蛋白形式表达，下列错误的是： A、基因操作简便 B、只能作抗原用 C、容易实现高效表达 D、易被细菌酶类水解21、目前应用最广泛的产酶菌是： A.大肠杆菌 B.枯草杆菌 C.青霉菌 D.链霉菌22、大肠杆菌的基因表达系统为 A、pBV220/pET B、YEp/YRp C、pUC/gt11 D、pBR322/gt1023、用于生产-干扰素的动物细

8、胞是A、Namalum Namalwa B、Vero C、WI-38 D、MIRC-524、外源基因在动物细胞与大肠杆菌中表达产物的要紧区不是 A.糖基化 B.产量高 C.性质稳定 D.疗效可靠25、基因表达最常用的宿主菌是A.大肠杆菌 B.枯草芽孢杆菌 C.链霉菌 D.酵母26、筛选杂交瘤细胞（脾-瘤融合细胞）选用的培养基是 A、HT B、HAT C、RMP1640 D、BME27、采纳凝胶过滤法分离单克隆抗体，最高峰属于 A、IgG B、IgM C、IgA D、IgE28、改造鼠源性单克隆抗体的首要目的是 A、降低相对分子量 B、增加组织通透性 C、降低免疫源性 D、延长半衰期29、鼠源性

9、单克隆抗体改造后得到小分子抗体，常用的是A、单域抗体 B、单链抗体C、Fab片段抗体 D、最小识不单位30、cDNA法获得目的基因的优点是：A.成功率高 B.不含内含子 C.操作简便 D.表达产物能够分泌 E.能纠正密码子的偏爱性三、配对选择题（每题只有一个正确答案，备选答案可多次被选，也可不选，1分10 = 10分）题 14 A、基因工程 B、细胞工程 C、酶工程D、发酵工程 E、生化工程1、生物技术的核心与关键是 A2、生物技术的基础是 E3、生物技术的条件是 B4、生物技术获得最终产物的手段是 D 题 58 菌种选育方式与所得到的菌种类型 A、自然选育 B、定向培育 C、诱变育种 5、抗

10、性菌株B 6、野生型菌株A 7、突变株C 8、营养缺陷型菌株C题 910 真核基因在大肠杆菌中表达的形式A、非融合蛋白 B、融合蛋白C、分泌型表达蛋白 D、糖基化蛋白 9、只能作抗原用 B 10、易被蛋白酶水解 A四、多项选择题（每题不只一个正确答案，210 = 20分）1、为了提高质粒稳定性，采纳的措施有A、选择合适的宿主菌 B、采纳二时期培养培养法C、选择合适的载体D、操纵培养条件，在培养基中加入选择性压力2、建立最佳的基因表达体系应考虑A.目的基因的表达产量 B.表达产物的生物学活性C.表达产物的稳定性 D.表达产物分离纯化的难易3、基因工程菌生产发酵的方式有 A、分批发酵 B、补料分批

11、发酵 C、半连续发酵 D、连续发酵4、动物细胞培养时常在培养基中加入小牛血清，其目的是A、提供生长因子和激素 B、提供结合蛋白C、提供贴附因子和伸展因子D、提供合适的pH缓冲系统E、提供必要的脂肪酸和微量元素5、酶在医药领域的应用包括 A.诊断 B.治疗 C.药物生产 D.分析检测6、提高基因表达产物稳定性的方法有A.组建融合基因产生融合蛋白B.利用大肠杆菌信号肽将产物转移到胞浆周质中C.采纳位点特异突变方法改变真核蛋白S-S位置D.采纳蛋白酶缺陷型大肠杆菌E.优化基因工程菌培养条件7、阻碍外源基因在大肠杆菌中表达效率的因素有A、启动子的强弱 B、核糖体结合位点的有效性C、SD序列和起始密码的

12、距离 D、密码子的组成E、外源基因的拷贝数量8、蛋白质药物化学修饰后的要紧特点是： A.循环半衰期延长 B.免疫原性降低或消逝 C、毒副作用降低 D、理化稳定性降低 E、生物稳定性增强9、菌种的选育方式包括 A、自然选育 B、诱变育种 C、杂交育种D、原生质体融合 E、基因重组10、基因载体导入动物细胞常用的方法有A、细胞融合法 B、磷酸钙沉淀法 C、电穿孔法D、显微注射法 E、重组逆转录病毒介导法五、问答题（4题，共25分）1、简述生物药物与生物技术药物的内涵。（5分）生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法，利用生

13、物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。生物药物，包括HYPERLINK /view/2414329.htm生物技术药物和原HYPERLINK /view/354542.htm生物制药。生物技术药物：是指采纳HYPERLINK /view/758.htmDNA重组技术或其他创新生物技术生产的治疗药物。细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物。生物技术药物学：近代药物学的一个重要分枝，是研究生物技术药物，尤其是基因工程药物和基因药物的一门新型综合学科。要紧内容包括生物技术药物的临床前研究与临

14、床评价、生物技术药物的生产工艺与生产治理、生物技术药物的质量操纵与安全性评价、各类生物技术药物的来源、结构、性质、作用与用途，比较系统地介绍生物技术药物在疾病防治、诊断有关的基础理论及其临床应用知识。2、简述单克隆抗体的制备。（5分）一对动物注射特定的抗原蛋白，使其产生HYPERLINK /search?word=免疫反应&fr=qb_search_exp&ie=utf8免疫反应；提取合成HYPERLINK /view/1276349.htm专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。二应用HYPERLINK /view/3873590.htm细胞杂交技术使HYPERLINK

15、/view/3873597.htm骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在HYPERLINK /view/3873512.htm体外培养增殖永存的特性。三对杂交瘤细胞进行细胞培养，用特定的选择培养基选出所需要的细胞群，体外或体内培养，从培养液或动物腹水中提取单克隆抗体。3、比较基因工程疫苗与传统疫苗？（5分）传统疫苗是用人工变异或从自然界筛选获得的减毒或无毒的活的病原微生物制成的制剂或用理化方法将病原微生物杀死制备的生物制剂。传统疫苗受制作工艺的限制，其保存、使用和接种副反应等方面都容易出现一些问题。 基因工程疫苗指使用重组DN

16、A技术克隆并表达爱护性抗原基因，利用表达的抗原产物，或重组体本身制成的疫苗。基因工程亚单位疫苗优点： 纯度高；产量高，可进行大规模生产。 易制备，可用于病原体难于培养或有潜在致癌性、免疫病理作用的疫苗研究。安全性好，不具感染性，接种后可不能发生急性、持续或埋伏感染。这种疫苗稳定性好，免疫期长，便于保存和运输；这些疫苗减少或消除了常规活疫苗或死疫苗难以幸免的热原、变应原、免疫抑制原和其它有害的反应原。 如何操纵基因工程药物的质量？（10分）原材料：要紧检查目的基因、表达载体及宿主细胞（如细菌、酵母、人和动物的细胞），防止其产生我们不想要的遗传变异。培养过程：不管是发酵依旧细胞生产，关键是保证基因

17、的稳定性和不被污染。要紧操纵生产用的细胞库、有限代次的生产、连续培养过程。纯化工艺过程：要求能保证去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白质、纯化过程带入的有害化学物质、致热原，或者将这类杂质减少至同意量。最终产品：要紧表现在生物学效价测定、蛋白质纯度检查、蛋白质的比活性、蛋白质的性质鉴定几个方面。杂质检测：蛋白类，由于降解、聚合或者错误折叠而造成的目的蛋白变构体在体内往往会导致抗体的产生；非蛋白类，要紧有细菌、病毒、热原质和DNA几种类型，往往在极低的水平就可产生严峻的危害作用。安全性试验：其中的无菌试验、热原试验、安全性和毒性试验按我国新颁布的中国生物制品规程进行。1. 什么是生物技术? 以生命

18、科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合进行加工生产，为社会提供商品和服务的综合性技术体系。1953年 Watson 和 Crick 提出DNA双螺旋结构模型；基因重组技术、单克隆技术、动/植物细胞培养技术等；是正在进展中的以DNA重组技术为核心的高技术综合体系，是当今国际优先进展的高技术领域之一。1953年 Watson & Crick提出DNA双螺旋结构1973年 建立DNA重组技术1975年 建立单克隆抗体技术1978年 大肠杆菌表达出胰岛素1988年 PCR方法1997年 英国克隆多利羊1998年 美国批准艾滋

19、病疫苗进行人体试验2000年 绘制出人类基因组草图2003年 第一个基因治疗药“重组腺病毒p53”应用重组DNA技术及其它转基因技术；细胞和原生质体融合技术；酶或细胞的固定化技术；植物脱毒和快速生殖技术；动、植物细胞的大量培养技术；动物胚胎工程技术；现代微生物发酵技术；现代生物反应工程和分离工程技术；蛋白质工程技术；海洋生物技术，等等。6.Trends of modern biotechnology基因操作技术日新月异，不断完善；新技术、新方法产生后被迅速应用；基因工程药物和疫苗的研究和开发突飞猛进；新的生物治疗制剂产业化前景十分光明；转基因植物、动物取得重大突破；新的生物技术将给农业生产带来

20、新的飞跃；生物体基因组及蛋白质结构与功能是研究的热点与重点；基因治疗取得重大进展，可能革新预防治疗领域；蛋白质工程生物信息学Section 2 Biotechnological drugs1. Basic concepts1、生物药物（biological drugs）与生物药物技术指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和治疗疾病的医药品。2、生物技术药物（biotechnological drugs）采纳DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。生物技术在制药上的应用基因工程制药抗体制药动（植）物细胞制药酶工程制药发酵工程制

21、药疫苗制备技术微生物转化核酸药物、基因治疗、细胞治疗蛋白质药物的化学修饰 Appendix : Classification of biological drugs按药物的化学本质和特性按原料来源按生理功能和临床用途按药物的化学本质和特性氨基酸及其衍生物类（amino acid & derivative）多肽和蛋白质类（polypeptide & protein）酶与辅酶类（enzyme & coenzyme）核酸及其降解产物和衍生物类（nucleic acid）糖类（carbohydrate）脂类（lipide）细胞因子类（cytokines）生物制品类（biological product

22、s）按原料来源人体组织来源的生物药物动物组织来源的生物药物植物组织来源的生物药物微生物来源的生物药物海洋生物来源的生物药物按生理功能和临床用途治疗药物（therapeutical medicine）预防药物（preventive medicine）诊断药物（diagnostic medicine）其他生物医药用品（biochemistry reagent， health product，cosmetics，medical material，etc）Appendix : Classification of biotechnological drugs 按来源分类1、应用重组DNA技术制造的基因重

23、组多肽、蛋白 质类药物；2、基因药物（基因治疗剂、基因疫苗、反义药物、 核酶等）；3、来自动物、植物和微生物的天然生物药物；4、合成与部分合成的生物药物。 按功能与用途分类 1、治疗药物 2、预防药物 3、诊断药物2. Features of biotechnological drugs 1、分子结构复杂 2、具有种属特异性 3、治疗针对性强，疗效高 4、稳定性差 5、基因稳定性 6、免疫原性 7、体内半衰期短 8、受体效应 9、多效性与网络性效应10、检验的专门性Section 3Biotechnological pharmaceutics1. Basic concepts生物技术制药 （b

24、iotechnological pharmaceutics） 采纳现代生物技术人为地制造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。2. Feature of biotechnological pharmaceutics1、高技术2、高投入3、长周期4、高风险5、高效益热门药物生物技术 技术 新颖性 技术 新颖性 组合化学 成熟领域 前导物综合 新生技术 鉴定技术 药学基因组科学 进展领域 核糖酶 新生技术 蛋白质工程 进展领域 抗体酶 新生技术 基因治疗 进展领域 药物设计 新生技术 与人工智能 糖类治疗剂 进展领域 功能抗原 新生技术 正在研究开发的生物技术药物类型 领域 开发

25、药物品种 领域 开发药物品种 单克隆体 78 人生长激素 5 疫苗 62 组织纤溶酶原激活剂 4 基因治疗 28 凝血因子 3 白介素 11 集落细胞刺激因子 3 干扰素 10 促红细胞生成素 2 生长因子 10 SOD 1 重组可溶性受体 6 其他 56 反义药物 6 总数 284 生物药品市场占有率分布 红细胞生成素 28% 重组人胰岛素 18% 干扰素 15% 集落刺激因子 15% 生长激素 11% 纤维蛋白溶酶原活化剂 4% 其他药品类 9% 医药生物技术是整个生物技术领域中最 为活跃的部分，将成为世界经济的支柱 产业之一。1、基因工程药物；2、基因治疗；3、诊断试剂、酶制剂；4、动、

26、植物医药产品；5、核酸类药物；6、利用现代生物技术改造传统生物药物。3. Application of biotechnology in Pharmacy 基因工程制药 细胞工程制药 酶工程制药 发酵工程制药 途 径1、用克隆的基因表达生产有用的肽类和 蛋白质类药物或疫苗；2、利用基因工程技术改造传统的制药工业 内 容1、基因工程药物品种的开发2、基因工程疫苗3、基因工程抗体4、基因诊断与基因治疗5、应用基因工程技术建立新药筛选模型6、应用基因工程技术改良菌种产生新的微 生物药物7、应用基因工程技术改进药物生产工艺8、利用转基因动、植物生产蛋白质类药物 单克隆抗体技术 动物细胞培养 植物细胞培

27、养生产次生代谢产物1、利用酶或细胞、细胞器具有的催化功能2、酶的固定化技术、流化床反应器3、完成一般化学合成难以进行的反应4、微生物转化1、工艺改进2、新药研制3、菌种改造生物技术制药的任务不断的研究、改进和完善基因重组、细胞工程、抗体工程、发酵工程、酶工程等技术，同时把其他学科的先进技术和生物技术结合在一起，制造和进展新的生物技术，研制和生产出各种蛋白质、多肽、抗体、疫苗、核苷类等药物及生物诊断试剂，为人类健康谋福。4. New progress of medical biotechnology 医药生物技术产业化、商品化成为高新技术产业之一。高投入、高风险、高利润,利润率达17.6%200

28、0年全世界销售额1490亿美元，2005年超过3000亿美元，2008年超过5000亿美元。 1、基础研究不断深入： Clone Human Genome Project Stem Cell，et al 2、新产品不断出现：基因工程疫苗、细胞因子、蛋白质类药物等 3、新试剂、新技术不断出现：Gene Therapy，McAb，PCR 4、新型生物反应器和新分离技术不断出 现：酶和细胞的固定化、流化床式反应器5. Medical biotechnology in our country在较短时刻内得到快速进展，取得明显成果；差距相当大（创新性、自主开发新品种、上/下游关系、产业化进展）。我国生物

29、技术药物1986年：2亿2000年：200亿2005年：280亿我国生物医药现状起步晚，进展较快，取得一定成效与发达国家比，仍有特不大的差距我国4000多家生物医药生产企业中将有2000家面临生存危机，绝大多数高端市场被跨国公司占据我国生物医药产业的要紧问题机制不对，能力不够，投入不足重复生产，规模小，效率低原创性专利少知识产权爱护意识差6. Prospects of medical biotechnology in our country 21世纪，生物技术药物、化学药物、植物药物为三大医药产业。利用新发觉的人类基因，开发新型药剂；新型疫苗的研制：艾滋病疫苗和基因型癌疫苗等基因工程活性肽的生

30、产：淋巴因子、生长因子、激素和酶 其它医药业的不断改造和进展：早期诊断技术、转基因药材。生物医药产业的前景展望21世纪将是生命科学的世纪，生物制药则是生物工程研究开发和应用中最活跃、进展最快的领域，目前总销售额超过10亿美元的生物技术产品要紧差不多上生物医药产品，生物医药产业因而成为21世纪最具进展潜力的朝阳行业。Bill Gates预言：超过他的下一个世界首富必定出自基因领域！第二章 基因工程制药Genetic engineering pharmaceutics内容提要基因工程药物生产的过程目的基因的获得基因表达基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌的不稳定性基因工程菌中试重组工程菌的培养高密度

31、发酵基因工程药物的分离纯化变性蛋白的复性基因工程药物的质量操纵第一节 概述 自20世界70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。基因工程技术的迅猛进展使人们已能够有效地生产许多以往难以大量获得的生物活性物质，甚至能够制造出自然界中不存在的全新物质。 1982年第一个基因重组产品人胰岛素（recombinant human insulin）在美国问世，吸引和激励了大批科学家利用基因工程技术研制新药品，迄今累计已有近150多种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益。基因工程生产的活性蛋白与多肽（1）免疫性蛋白：各种抗原和单克隆抗体（2）细胞因

32、子：INF、IL、CSF、EGF、凝 血因子（）等（3）激素：胰岛素、生长激素、心钠素等（4）酶类：尿激酶、链激酶、葡激酶、重 组型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化 物歧化酶等 基因工程技术生产药品的优点（1）生产以往难以获得的生理活性蛋白和多肽；（2）提供足够数量的生理活性物质进行深入研究 和扩大应用；（3）开发更多的内源性生理活性物质；（4）改造内源性生理活性物质作为药物的不足；（5）可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。第二节 基因工程药物生产的差不多过程 差不多原理 将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行

33、复制和表达的技术基因工程技术。 上游时期： 首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。 选择基因表达系统要紧考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。上游时期在实验室完成。 下游时期： 将实验室成果产业化、商品化。要紧包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化操纵、高纯度纯品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化操纵等。（优化发酵工艺、提高和保证产品质量）第三节目的基因的获得应用基因工程生产药物，

34、首先必须构建一个特定的目的基因无性生殖系（即产生各种新药的、不同的基因工程菌株）。来源于真核细胞的目的基因不能直接分离得到，只能拷贝DNA的专门小一部分（10-5-10-7）。真核基因一般都有内含子。原核细胞表达时缺乏mRNA转录后加工系统，mRNA不成熟，即不能直接克隆真核基因。克隆真核基因方法：逆转录法、化学合成法、PCR法、基因文库法 真核基因克隆方法一、逆转录法原理逆转录法是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。 1、mRNA的纯化mRNA的特点：3末端含有一多聚腺苷酸（polyA） 组成的末端，能吸附于寡聚脱氧腺苷酸（dT）纤维素柱上。分离方法

35、：亲和层析法 2、cDNA第一链的合成一般 mRNA都带有3polyA，因此能够用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。检测方法：用放射性探针法 3、cDNA第二链的合成以cDNA第一链为模板合成第二链。 4、cDNA克隆用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA和噬菌体。又将其分为表达型载体和非表达型载体。选用表达型载体能够增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。 cDNA片段与载体的连接常采纳下面方法： （1）加同聚尾连接：在载体和cDNA的3-末端加上互补的同型多聚酶序列。 （2）人工接头连接：所谓人工接头是指用人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切点

36、的寡核苷酸片断。 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定 （1）核酸探针杂交法 （2）免疫反应鉴定法真核基因克隆方法 逆转录法过程二、逆转录聚合酶反应法 该方法是mRNA经逆转录合成cDNA第一链，不需再合成第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。三、化学合成法 1、化学合成法前提条件明白目的基因的核苷酸排列顺序明白目的蛋白质的氨基酸顺序 2、化学合成法不足不能合成太长的基因选择密码子困难费用高四、筛选基因的新方法 编码序列富集法 岛屿获救 PCR 法 动物杂交法 功能克隆法 构建 cDNA 文库

37、 差异显示技术的应用编码序列富集法利用磁力对cDNA文库中的目的基因进行富集的技术。质粒DNA库酶切后连上接头5端用生物素标记的与接头序列相同的引物进行PCR 扩增cDNA文库的插入片段同法扩增杂交得到带有生物素的DNA双链加含有磁珠核心的链霉抗生素蛋白DNA双链结合磁珠外磁场下，目的基因与其他DNA片段分离。岛屿获救PCR法直接从已测序的基因组DNA上查找杓码序列，经计算机分析找出开放阅读框，用外显子陷阱法和查找CpG岛的方法克隆编码基因。动物杂交法利用已知序列的其他物种的基因从构建的人基因组文库或cDNA文库中将目的基因调出。如同源性高的基因、基因家族成员间的序列相似性等。功能克隆法依靠基

38、因表达产物和生物学功能的基因克隆法。可采纳基因敲除术、RNA干扰术、酵母双杂交技术、高通量表达技术、流式细胞术等手段，从基因水平、表达调控水平、蛋白质水平、细胞水平获得基因功能信息。构建cDNA文库通过表达序列标签（EST）进行基因作图和基因组序列中编码序列的鉴不，用PCR技术扩增基因组中的特异片段。差异显示技术的应用利用mRNA差异显示技术、减数PCR技术、差减杂交技术等查找新基因。如通过正常组织与肿瘤组织某些基因和蛋白质的差异表达，查找在肿瘤细胞中高表达基因或沉默基因，推测其是癌基因或抑癌基因。五、对已发觉基因的改造对基因的功能相关区域研究，采纳基因修饰技术和点突变技术进行基因新功能研究和

39、再确证，从而提高目的基因表达产物的稳定性和体内半衰期，提高表达产物的生物学活性，降低有效使用剂量或提高表达量，降低毒性或免疫原性。第四节 基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片断，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。关键问题建立最佳的基因表达体系 （1）目的基因的表达产量 （2）表达产物的稳定性 （3）表达产物的生物学活性 （4）表达产物的分离纯化一、宿主细胞的选择选择宿主细胞的条件1）易获得较高的浓度2）能利用易得价廉原料3）不致病、不产生内毒素4）发热低、

40、需氧少、发酵温度/细胞形态适当5）易进行代谢调控6）易进行DNA重组技术操作7）产物的产量、产率高，易提取纯化宿主细胞分类（1）原核细胞 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等（2）真核细胞 酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等 【原核细胞】大肠杆菌*（1）高效、表达产物形式多样、杂质多（2）胞内表达为主，提取困难（破裂细胞）（3）分泌不足，需在下游经变性/复性处理（4）无修饰作用，不能糖基化，应用受限制（5）N-端含甲硫氨酸残基，易致免疫反应（6）产生内毒素、蛋白酶等枯草芽孢杆菌 （1）分泌能力强 （2）不能糖基化 （3）胞外蛋白酶强链霉菌（1）不致病、安全（2）分泌能力强（3）有糖基化能力（4）变铅青

41、链霉菌限制修饰能力弱（理想）【真核细胞】酵母（酿酒）* （1）基因组小、易调控、高效 （2）生殖迅速、价廉、无毒 （3）分泌能力强 （4）能糖基化丝状真菌 （1）种类多（30）、易得、安全 （2）分泌能力强 （3）能正确进行翻译后加工（剪切/糖化） （4）糖化程度高哺乳动物细胞 （1）能分泌、易调控、易纯化 （2）糖基化产物，接近天然 （3）生产慢、产率低 （4）培养条件苛刻、费用高二、大肠杆菌中的基因表达表达载体必须具备的条件 （1）能独立复制（严紧型/松弛型） （2）有灵活的克隆位点、筛选标记方便 （3）启动子强、易被RNA聚合酶识不 （4）有阻遏子，操纵启动子在诱导时才转录 （5）终止子

42、强，要紧转录克隆的外源基因 （6）产生的mRNA有起始翻译信号（AUG与SD 序列），转录后能顺利翻译 pBV220系统、pET系统阻碍目的基因在大肠杆菌表达的因素（1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表达效率 启动子的强弱 核糖体结合位点的有效性 SD序列和起始密码AUG的距离 密码子组成（3）表达产物的稳定性减少降解 组建融合基因 利用信号肽转移产物 位点特异突变而改变蛋白S-S位置 选用蛋白酶缺陷型菌株（4）细胞的代谢负荷（二时期培养）（5）工程菌的培养条件真核基因在大肠杆菌中的表达形式（1）融合蛋白形式： 由一段短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的蛋白质。N-原核序列C-真核序列（2）非

43、融合蛋白形式 启动子-SD序列-起始密码子-结构基因-终止密码（3）分泌型三、酵母中的基因表达酵母表达系统载体（1）载体的复制序列 YEp（酵母附加体质粒） YRp（酵母复制型质粒） YCp（酵母着丝粒质粒） Yip （酵母整合型质粒）（2）克隆载体： 由于从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的。（3）表达载体：一般/精确阻碍目的基因在酵母菌中表达的因素（1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表达效率 启动子/分泌信号的效率/终止序列的阻碍（3）外源蛋白的糖基化（4）宿主菌株的阻碍 菌体生长力强、内源蛋白酶弱、菌株性能稳定、分泌能力强四、动物细胞中

44、的基因表达第五节基因工程菌生长代谢的特点菌体生长速度反映蛋白质的合成速度操纵菌体生长可提高质粒稳定性、减少代谢副产物的积存、提高外源性蛋白产率能量的供应决定菌体的最大比生长速率小分子前体和催化组分的限制决定菌体的最大比生长速度一、菌体生长与能量的关系（1）菌体生长由呼吸操纵，碳源通过有限的呼 吸能力所能提供最大能量决定菌体在该培 养基的最大比生长速率。（2）菌体生长所需能量大于有氧代谢所能提供 的能量时，菌体产生的代谢副产物乙酸能 抑制菌体的生长，尤其在高密度培养时， 提高培养基pH可减弱乙酸的作用。（3）分批培养中选用不同的碳源、补料培养 中操纵补料速度、连续培养中操纵稀释 速率等，通过降低

45、供能速度和前体供应 速度来操纵菌体的糖酵解速度，使之低 于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力， 减少乙酸产生和抑制，在一定范围能操纵 菌体生长，实现高密度培养和提高产物的 表达水平。一、菌体生长与能量的关系实质 操纵菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而幸免乙酰辅酶A的积存和乙酸的产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度。二、菌体生长与前体供应的关系（1）培养基中加入氨基酸能提高菌体比生长速率，使 蛋白合成增加。（2）菌体中小分子前体量和催化结构有限，各个基因 相互竞争共同的前体和催化结构限制了菌体的比 生长速率。基因表达在各个水平的竞争又是各个

46、基因互相竞争共同的前体和催化结构的结果。由 于基因工程菌质粒的复制和外源基因的转录和翻 译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构， 从而加剧了这些成分的不足，因而在同样的培养 基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细 胞，特不是工程菌诱导后，由于外源基因的大量 表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。（3）在中等拷贝质粒（56）工程菌中，外源基因的复 制、转录、翻译引起菌体内前体浓度的降低，可 诱导与前体合成有关的酶相对水平增加（与宿主 细胞比）。（4）在高拷贝质粒（240）工程菌中，前体大量被利 用而引起不足，产生“严紧反应”（ppGpp），核糖 体及有关酶水平比宿主细胞低。“严紧反应”

47、：当氨酰tRNA不足时，核糖体在密码子上停留，合并成被称为“魔点”的ppGpp的结果。第六节基因工程菌的不稳定性一、质粒的不稳定性基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，又分为分裂不稳定和结构不稳定。分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。质粒不稳定产生的缘故分裂不稳定、结构不稳定二种类型（1）含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率（2）两种菌的比生长速率差异的大小 （质粒拷贝数低/高）质粒稳定性的分析 将工程菌培养液样品适当稀释，在不含抗性标记的平板培养基培养10-12h，随机选100个菌落接种到含

48、抗性标记的培养基培养10-12h，统计长出的菌落数，计算比值ST（stability）二、提高质粒稳定性的方法（1）选择合适的宿主菌 宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等。（2）选择合适的载体低拷贝质粒工程菌不含质粒子代频数大高拷贝质粒工程菌比生长速率低于不含质粒菌调控比生长素率可改变质粒拷贝数（3）两时期培养法 使菌体生长至一定密度 诱导外源基因的表达（4）在培养基加入选择性压力 （加入抗生素抑制质粒丢失菌的生长）（5）操纵培养条件 （温度、pH、培养基组分、溶解氧浓度）（6）固定化第七节基 因 工 程 菌 中 试中试应考虑的问题： 适合商品化生产

49、的工程菌 设计发酵反应器 选择反应过程 发酵培养基组分 维持生产工艺最佳化的方法 工艺监测、操纵、自动化使用方法 生物催化剂的使用 产品分离、纯化方法一、工程菌选择（条件） 能用一般基因重组技术获得 有高产潜力 能以工业原料（碳源）为培养基 生产工艺能用一般工业生产经验 能产生、分泌蛋白质 不致病、无毒性 生产安全，符合国家卫生部门规定 代谢能操纵 产品有特异性 发酵液黏度小二、反应器（发酵罐）设计符合生物反应与化学工程的需要设计前的生物数据：培养细胞系特性、细胞生长率、发酵罐消毒方法、温度、溶氧、pH、CO2、代谢产物、后处理效果等设计要求：能连续发酵和分批发酵；附有加料管、取料管、测量仪表

50、；易安装与移动；仪表数据可靠，重现性好；可任意装置附件；罐体为不锈钢、光滑。三、发酵培养基组成提供化学元素：C、N、O、H、P、微量 元素、金属离子等提供专门营养：氨基酸、维生素等提供能源：葡萄糖等操纵代谢：加入活性物质、改变温度和 pH等四、工艺优化与参数监控优化工艺：周期短、产量高、质量好、消耗低、安全性高、废物处理周全、速度快、失败率低等综合指标。监控数据：1）要紧参数：pH、温度、溶氧、CO22）生物量：浊度、细胞组分、总氮量、菌丝干重3）碳源：糖、有机酸、乙醇、淀粉、脂质4）产品五、计算机的应用 优化生产工艺 降低劳动强度 自动化第八节重 组 工 程 菌 的 培 养基因工程菌的培养过

51、程（1）摇瓶操作：了解工程菌生长的基础条 件（温度、pH、培养基组分及C/N）， 分析表达产物的合成、积存对受体细 胞的阻碍。（2）培养罐操作：确定培养参数、操纵方 案及顺序。一、基因工程菌的培养方式（1）补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，通过一段时刻后，间歇或连续地补加新奇培养基，使菌体进一步生长的培养方式。溶氧、流加补料（2）连续培养：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以操纵一定稀释率进行不间断的培养。两时期连续培养，操纵和优化诱导水平、稀释率、细胞比生长速率。（3）透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产

52、物来解除其生产菌的不利阻碍。（4）固定化培养：维持质粒稳定性（5）分批培养DO-Stat法：调节搅拌转速和通气速率操纵溶氧在20%，补料的流加速率是关键。Balanced DO-Stat法：操纵溶氧、搅拌转速、糖的流加速率，使乙酸维持在低浓度。操纵菌体比生长速率的方法：在最优表达水平获得高密度、高表达。二、基因工程菌的培养工艺基因工程菌发酵工艺的阻碍因素（1）培养基的阻碍（C、N、无机盐、维生素、微量元素等）常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营

53、养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。 （2）接种量的阻碍（取决于菌种在发酵中的生长生殖速度）接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占据整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。因此接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长生殖速度。 （3）温度的阻碍（复制、转录、翻译、调节分子的合成）在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，阻碍基因表达；在转录水平上，可通过阻碍RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；温度也可在mRNA降解和翻译水平上阻碍基因表达，温度还可能通

54、过细胞内小分子调节分子的量而阻碍基因表达，也可通过阻碍细胞内ppGpp量调控一系列基因表。温度还阻碍蛋白质的活性和包含体的形成。（4）溶解氧的阻碍（调节搅拌转速前期低/后期高）溶解氧是工程菌发酵培养过程中阻碍菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成阻碍专门大。外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。通常采纳调节搅拌转速的方法，能够改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。 （5）诱导时机的阻碍（温度、氧、营养） 一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。（6）pH的阻碍（细胞生长期、外蛋白表达期）pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有阻碍，因此应依照工程菌的生长和代谢情

55、况，对pH进行适当的调节。（7）诱导表达程序的阻碍：热诱导总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。基因工程菌的培养设备（自学）第九节 高密度发酵（见发酵工程）第十节基因工程药物的分离纯化基因工程产品的特点（1）目的产物在初始物料中含量较低（2）含目的产物的初始物料组成复杂（3）目的产物的稳定性差，易失活/变性（4）生物活性物质种类繁多（5）应用面广，对质量、纯度要求高，甚 至要求无菌、无热原等因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。一、建立分离纯化工艺需了解的各种因素（1）含目的产物的起始物料的特点 菌种类型及代谢

56、特性 原材料和培养基的来源及质量 生产工艺与条件 初始物料的理化特性与生物学特性（2）物料中杂质的种类和性质（3）目的产物特性（4）产品质量的要求二、分离纯化的差不多过程分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过45个步骤，包括细胞破裂、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。三、分离纯化技术分离纯化技术的要求 （1）技术条件和气，保持产物活性 （2）选择性好 （3）收率高 （4）技术能衔接，减少工艺步骤 （5）分离速度快，能满足高生产率要求三、分离纯化技术（1） 细胞破裂与固液分离（1）细胞收集：离心法、膜过滤法（2）细胞破裂： 机械破裂法：高压匀浆法、超声

57、破裂法、 高速珠磨法、高压挤压法 非机械破裂法：酶溶法、化学渗透法、热 处理法、渗透压冲击法（3）固液分离： 离心、膜过滤、双水相分配三、分离纯化技术（2） 目的产物的分离纯化色谱分离方法 （1）离子交换色谱：正吸附、负吸附 （2）反相色谱与疏水色谱： （3）亲和色谱： （4）凝胶过滤色谱：蛋白质纯化方法的设计通常依照产物分子的物理、化学参数和生物学特性。选择纯化方法应依照目的蛋白质和杂蛋白的物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质的差异。三、分离纯化技术（2） 目的产物的分离纯化产物特性 作 用等电点 决定离子交换的种类与条件相对分子量 选择不同孔径及分离范围的介质疏水性 与疏

58、水、反相介质结合的程度专门反应性 产物的氧化、还原及部分催化性能的抑制聚合性 是否采取预防聚合、解聚及分离除去聚合体生物特异性 决定亲和配基溶解性 决定分离体系及蛋白浓度稳定性 决定工艺采取的温度及流程时刻微不均一性 阻碍产物的回收（1）离子交换色谱（ion exchange chromatography,IEC）差不多原理是通过带电的溶质分分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。蛋白质的等电点和表面电荷的分布要紧阻碍其离子交换的性能，阻碍蛋白质离子交换色谱保留的其他因素，还有交换基团和交换介质的种类、吸附和洗脱的条件等。（2）反相色谱（reversed phase chr

59、omatography,RPC）和疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography,HIC）反相色谱和疏水色谱是依照蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。（3）亲和色谱（ affinity chromatography,AC）亲和色谱是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附的 。亲和色谱的过程大致分为3步：第一步配基固定化;第二步吸附目的产物；第三步样品解吸。（4）凝胶过滤色谱凝胶过滤是以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差不可使大分子与小分子分开。三、分离纯化

60、技术（3） 非蛋白类杂质的去除去除DNA、热源、病毒等方 法 目 的离心/过滤 去除细胞、碎片、颗粒性杂质（病毒）阴离子交换 去除杂质蛋白、脂质、DNA、病毒阳离子交换 去除牛血清蛋白或转铁蛋白超滤 去除沉淀物、病毒疏水层析 去除残余杂质蛋白凝胶过滤 与多聚体分离40nm微孔滤膜 去除病毒0.22m微孔滤膜 除菌四、选择分离纯化方法的依据 （1）依照产物表达形式 （2）依照分离单元间的衔接 （3）依照分离纯化工艺的要求具有良好的稳定性和重复性尽可能减少组成工艺的步骤工艺步骤间相互适应、协调工艺过程中尽可能减少试剂工艺所用时刻工艺技术必须高效、收率高、易操作、设备要求低具有较高安全性第十一节变性