分子肿瘤课件

1、 COX-2抑制剂塞来昔布诱导人肝癌细胞凋亡及其机制 目的: 探讨环氧合酶-2( cyclooxygenase-2, COX-2)抑制剂塞来昔布(celecoxib) 诱导人肝癌细胞系SMMC7721凋亡的作用及其可能机制。2方法: 以10、25、50、75、100mol/L的塞来昔布处理SMMC-7721细胞, MTT法检测肿瘤细胞增殖, Hoechst 33342/PI双染法检测细胞凋亡的形态特征, 流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期变化。RT-PCR 法检测Fas和Bcl-2mRNA 的表达,Western blotting检测细胞Fas和Bcl-2蛋白的表达。3 环氧合酶(cycloo

2、xygenase, COX)是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶。目前发现的环氧合酶主要有两种, 即环氧合酶1(cyclooxygenase-1, COX-1)和环氧合酶2(cyclooxygenase-2, COX-2)。其中, COX-2与肿瘤关系密切。COX-2在肝炎、肝硬化及肝癌组织中均呈高表达, 且COX-2与肝癌的分化程度、转移及预后均密切相关 。4 Fas /FasL Fas 介导凋亡先由不同的胞质蛋白与受体(FasL)的死亡域结合，然后连接蛋白即Fas 相关死亡域蛋白(Fasassociated death domain protein，FADD)直接与Fas死亡域结合，FADD激

3、活上游Caspase(如Caspase 8，10)，进而活化下游效应Caspase(如Caspase3，7)，导致细胞死亡。5 Bcl2家族分两大类，一类是抗凋亡蛋白，主要包括Bcl2，BclXL，Bclw，Mcl1 等; 另一类是促凋亡蛋白，主要包括Bax，Bak，Bad，Bid，BclXS，Bik /Nbk，BNIP3，Bim和Blk等。Bcl2基因及其表达蛋白可抑制多种组织细胞的凋亡和延长细胞寿命，故将其称为凋亡抑制基因。Bax是与Bcl2共免疫沉淀的蛋白可以诱导细胞色素c 的释放，激活caspase3蛋白酶，引起细胞凋亡，因此认为bax是重要的促凋亡基因之一。Bax定位于胞质溶胶中，自

4、身形成同源二聚体或与Bcl 2形成异源二聚体。研究表明Bcl2 /bax的比值对细胞凋亡的发生具有决定性作用。Bcl2表达bax表达时，Bcl2与Bax的异源二聚体增多，细胞趋于存活; Bcl2 表达bax表达时，则Bax本身形成同源二聚体占主导，细胞趋于凋亡。7方法1. 1 细胞培养 SMMC-7721细胞培养在含10% 热灭活小牛血清、100/ml青霉素、100g/ml链霉素的RPM1640培养液中, 于37、5%CO2的饱和湿度条件下培养, 取指数生长期细胞进行实验。1.2 MTT法检测塞来昔布对SMMC-7721细胞生长的抑制作用 将SMMC-7721细胞密度调整至5104/m ,l接

5、种96孔板,每孔100l,培养24 h后分别加入塞来昔布,使终浓度分别为10、25、50、75、100mo l/L。设对照组(不加药) 和空白组(培养液中无细胞),每组设8个复孔。在药物作用24 h时,加入MTT(5mg/ml)20l继续培养4h后离心,弃上清,加DMSO150l,避光振荡15 min, 在全自动酶标仪上测定570nm处光密度度(D) 值。生长抑制率(% ) =(对照组D-实验组D )/(对照组D-空白组D )*100% 。81. 4 Hoechst 33342 /PI 双荧光染色法检测塞来昔布作用后SMMC-7721细胞凋亡的形态学改变 25、50、100mol/L塞来昔布处

6、理SMMC-7721细胞24h,收集细胞,PBS洗涤2次,移入Eppendorf管中, 用200lPBS悬浮细胞,加入Hoechst33342/PI染液(1：1) 40l，37染色8 min, 1 000*g离心10 min, 弃上清,用PBS 吹打混匀,涂片,在荧光显微镜下观察并照相。101.5 RT-PCR法检测塞来昔布作用后SMMC-7721细胞Fas、Bcl-2基因的表达 以-actin作为内标;应用Omiga2.0设计Fas、Bcl-2的引物(Fas上游引物为5GACCCAGAATAC-CAAGTGCAGATGTA-3,下游引物为5CT-GTTTCAGGATTTAA GGTT GGA

7、GATT-3,扩增产物为296 bp; Bcl-2上游引物为5-CTTCACTTGTGGC-CCAGATAGG-3,下游引物为5-GGTGCCACCTGT-GGTCCACCT-3;扩增产物为450 bp)。以25、50、100mol /L塞来昔布处理SMMC-7721细胞24h,用TRIzo l法提取细胞总RNA, 以紫外分光光度计测RNA 的含量和纯度( RNA 在260 nm 和280nm的光密度比值在1.8 2.0),以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性( 28 S和18 S RNA 条带比值2.0),11用1g细胞总RNA进行逆转录, 条件如下: 30、10min, 42、30 min,

8、99、5 min, 5、5 min。将上述逆转录产物按RT-PCR试剂盒进行扩增反应, 循环条件: 预变性94、2 min,变性94、30s, 退火58、1min, 延伸72、1min。33个循环后72延伸5 min。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳, 结果用凝胶自动成像2000系统扫描,取其积分值作为量化指标,以特异性基因条带与-actin基因条带的积分比值表示样本的相对量。以3次实验结果的均值做统计学分析。121. 7 统计学分析 所有用SPSS12.0软件处理, 两样本均数的比较采用t检验, 多组比较采用单因素方差分析。P 0.05为差异有统计学意义。142 结果2.1 塞来昔布对SMMC

9、-7721细胞生长的抑制作用 10、25、50、75、100mol /L 塞来昔布作用SMMC-7721细胞24h, 对细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性, 细胞生长抑制率分别为( 6.980.61)% 、(32.612.42)% 、(50.424.15 )% 、(68. 146. 50)% 和(88. 157. 15)%。塞来昔布作用于SMMC-7721细胞24 h的半数抑制剂量约为50mol / L。15172. 3 塞来昔布浓度依赖性诱导SMMC-7721细胞凋亡和细胞周期阻滞 流式细胞术检测结果(图2、表1)显示, 25、50、100mo l /L 塞来昔布处理SMMC-7721细胞24

10、h即可明显诱导凋亡, 随药物浓度增加, 细胞凋亡率也显著增加; 细胞周期随药物浓度增加也发生明显改变, 其中G0 /G1 期细胞比例明显增加, G2 /M 期细胞比例逐渐减少, 可见细胞被阻滞于G0 /G1 期。1819202. 4 塞来昔布对SMMC-7721细胞Fas、Bcl-2基因表达的影响 RT-PCR结果(图3、表2)显示, 不同浓度塞来昔布作用细胞24 h后, Bcl-2 mRNA 表达强度无明显改变; 25mol/L塞来昔布作用24 h后, Fas mRNA表达即显著增加(P 0.05), 而100mol/L塞来昔布可明显降低Bcl-2 蛋白表达强度(P 0. 01)。25mol

11、/L、50mol/L和100mol/L塞来昔布作用于SMMC7721细胞24 h后, Fas蛋白表达强度较对照组均明显升高(P 0.01)。2425讨论 近期的研究表明：COX-2抑制剂具有抗肿瘤作用, 其具体机制包括抗血小板作用、抑制瘤组织血管生成 、 抑制肿瘤细胞侵袭和转移，COX-2抑制剂以上作用的机制均通过COX-2途径来实现。 COX-2抑制剂对多种人类肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用, 如前列腺癌、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞, 但对其分子机制和信号转导途径的研究仍然较少, 值得进一步研究。27 在我们观察的这个实验中，选用人肝癌细胞系SMMC-7721为靶细胞, 探讨了COX-2抑

12、制剂塞来昔布对肝癌细胞的作用及其分子机制。 而塞来昔布作为一种临床常用的药物，价格并不昂贵，对于临床来讲，有着良好的应用前景。28 本实验显示, 塞来昔布对SMMC-7721具有抑制增殖及诱导凋亡的作用, 25mo l/L 的塞来昔布作用于SMMC-7721后即出现染色体浓集、细胞皱缩、凋亡小体形成等凋亡特征, 且随药物浓度增高, 出现部分细胞坏死, 而细胞增殖率明显下降。29 为进一步探讨塞来昔布对SMMC-7721细胞凋亡的作用机制,本研究选择了与细胞凋亡密切相关的Fas和Bcl-2为靶分子, 检测塞来昔布作用对细胞内F as和B cl-2基因表达与蛋白表达的改变。 目前认为, 细胞凋亡途

13、径可分为依赖于caspase途径和非依赖caspase途径 , 而前者又分为细胞凋亡的外在途径和细胞凋亡的内在途径。30关于Fas和Bcl-2 Fas又称作APO-1/CD95, 属TNF受体家族, 是细胞最基本的死亡配体之一, 主要介导细胞凋亡的外在途径。在肿瘤细胞中, Fas表达下调且对其特异性配体敏感性下降, 使肿瘤细胞得以逃避凋亡程序的启动。 Bcl-2家族是最重要的凋亡调节因子之一, 其中Bcl-2是主要的抗凋亡和促凋亡成员, 它通过改变线粒体膜通透性来调节细胞的凋亡。在细胞中Bcl-2主要介导细胞凋亡的内在途径, 在许多肿瘤细胞呈高表达。31塞来昔布对Fas-2的影响 本研究发现, 利用塞来昔布干预肝癌SMMC-7721 细胞24 h后, 细胞内Fas mRNA 及蛋白表达明显提高, 呈浓度依赖性, 提示塞来昔布可能通过上调Fas蛋白表达,增加细胞对凋亡信号的敏感性, 并介导细胞凋亡的外在途径来启动凋亡程序, 从而达到其抑制肿瘤细胞增殖的作用。32塞来昔布对Bcl-2的影响 RT-PCR 实验发现, 不同浓度的塞来昔布对Bcl-2mRNA 表达无显著影响; Western blotting 结果发现, 25及50mol/L塞来昔布对Bcl-2蛋白表达无明显影响, 但100 mol/L的塞来昔布可下调Bcl-2蛋白的表达。提