细胞染色体显示和分带技术示范课件

1、细胞染色体显示和分带技术细胞染色体显示和分带技术（优选）细胞染色体显示和分带技术（优选）细胞染色体显示和分带技术一、X染色质显示法女性X染色质 Barr氏体位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体，易被碳酸复红或硫堇等染料着色 结果细胞质不着色，细胞核染成紫红色，核内Barr 小体呈三角形/半月形。一、X染色质显示法女性X染色质 Barr氏体位于间期细胞核内二、Y染色质显示法男性Y染色质 盐酸阿的平染色法结果Y染色质呈特别明亮的黄绿色荧光园点，可位于核内任何位置，但多见于中央部位，二、Y染色质显示法男性Y染色质 盐酸阿的平染色法第二节 培养细胞染色体显示法一、原理显示染色体要选择分裂中期细胞，

2、因细胞分裂处于中期时，染色体的长短和大小恰到好处，是研究染色体的最好阶段。获得多量的中期分裂相及染色体分散均匀的理想分裂相可采取的措施如下:第二节 培养细胞染色体显示法一、原理1提高细胞分裂相数（1）细胞的选择和处理 大多数传代细胞应选择对数生长期的细胞。初代淋巴细胞常用有丝分裂源PHA、ConA等刺激细胞。（2）阻抑中期分裂 用秋水仙素(Colchicine)，现常用它的衍生物秋水仙胺(Colcemid)来破坏细胞有丝分裂中的纺锤丝，以发挥阻抑分裂中期的作用。由于DNA合成并无干扰，因此随时间延长可截获很多中期分裂相，一般的用量秋水仙素0.040.8mg/L培养液，秋水仙胺0.0040.08

3、mg/L培养液。作用时间为26小时。1提高细胞分裂相数（1）细胞的选择和处理 大多数传代细胞2促染色体分散措施（1）低渗处理 一般用0.075mol/L，在37水浴中将上述细胞处理2040分钟，可使细胞体积胀大，染色体松散。（2）固定 常用醋酸甲醇(1:3)混合液，用时现用现配。显示染色体方法很多，以下几种方法较为常用。2促染色体分散措施（1）低渗处理 一般用0.075mo二、传代细胞染色体检查一、原理秋水仙碱可使细胞停止在分裂中期，染色体长短恰倒好处。二、方法 细胞类型传代细胞系，外周血LC，羊水，绒毛细胞等方法秋水仙素 低渗固定染色镜检二、传代细胞染色体检查一、原理秋水仙碱可使细胞停止在分

4、裂中末梢血培养法，Giemsa染色法显示人染色体末梢血培养法，第三节 染色体结构显示和检测一、染色体显带原理和种类二、染色体显带方法要点三、原理四、常用染色体显带法五、姐妹染色单体分化染色第三节 染色体结构显示和检测一、染色体显带原理和种类一、染色体显带原理和种类（一）原理染色体显带是沿着整个染色体的长轴，能显现出着色深浅不同。 横行走向的带(Band)经特殊染色后，易着色的阳性带(Positive Band)为含有AT多的染色体节段，相反，GC多的则不易着色，为阴性带(Negative Band)。有报道，已被定位的正常基因和异常基因绝大部分都在阴性带区。人们推测，看家基因在阴性区带，人染色

5、体能显示出近2000个G带。一、染色体显带原理和种类（一）原理（二）种类染色体显带是指沿着整个染色体轴能出现着色深浅不同的横纹。根据显带方法不同可分为用奎吖因(QM)、阿的平(QD)荧光染色的带，称“Q”带；用Giemsa染色显带称“G”带；用Giemsa染色显示异染色质部分称“C”带；用特殊方法处理后，显现出与Q带和G带相反的带型称“K”带等。目前，Q、G和C三种带型较为常用，其中G带更为多用。（二）种类染色体显带是指沿着整个染色体轴能出现着色深浅不同二、染色体显带方法要点“老化”处理将染色体制片后存放310分钟或86干燥2030分钟 显Q带法用奎吖因(QM) 或阿的平(QM)染色显带Gie

6、msa显G带胰酶消化 Giemsa染色显带显C带法 在预热至65的5%Ba(OH)2液中15分钟 Giemsa染色15分钟显带注意1、标本片老化处理很重要；2、胰酶浓度和消化时间要事先熟知，消化要充分但不能过度；3、中期分裂相要多而均匀，稍长一些为佳二、染色体显带方法要点“老化”处理将染色体制片后存放3101中期染色体为了获得满意的显带效果，需制备质量好的中期染色体标本，即须达到以下要求长度适宜，一般稍长一些，能显出更多的条带，这与加入秋水仙素的浓度和作用时间有关，要控制好。染色体分散均匀无重叠，这与低渗有关，低渗不足染色体易发生重叠，过度易流失。无严重单体分叉。1中期染色体为了获得满意的显带

7、效果，需制备质量好的中期染2特殊处理中期染色体标本显带效果的提高要经三个步骤（1）标本片应先放置一段时间，称“老化”处理，以310天为宜。（2）显带染色前要将标本加温预处理利于显带，预处理后的标本不必再老化。常用80干燥2030分钟。（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。2特殊处理中期染色体标本显带效果的提高要经三个步骤2促染色体分散措施25%胰蛋白酶热消化715分钟，并不断轻轻摆动玻片，水洗后再用Giemsa染液染510分钟，用自来水冲洗，蒸馏水漂洗，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。（1）低渗处理 一般用0.（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。男性Y染色质

8、 盐酸阿的平染色法(2)将标本放于4080烤箱中数小时或更长，用0.女性X染色质 Barr氏体位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体，易被碳酸复红或硫堇等染料着色0的磷酸缓冲液漂洗2次，每次5分钟，于玻片上滴加12滴新鲜缓冲液，加盖片。初代淋巴细胞常用有丝分裂源PHA、ConA等刺激细胞。细胞被培养在含有5溴脱氧尿苷(5Bromode Oxyurdine;BUdR)的培养基中，当细胞DNA合成时，BUdR取代胸腺嘧啶核苷(Thymidine.（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。制片细胞培养时加入BUdR ，淋巴细胞于37培养4872小时后加秋水仙碱按染色体常规制片法制片。二、传

9、代细胞染色体检查二、染色体显带方法要点8)，56温浴10分钟后，用现配的胰酶一Giemsa混合液消化和染色1030分钟，染色后用自来水冲洗，再用蒸馏水漂洗数次，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。女性X染色质 Barr氏体位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体，易被碳酸复红或硫堇等染料着色方法秋水仙素 低渗固定染色镜检显Q带法用奎吖因(QM) 或阿的平(QM)染色显带预处理或老化是显带的重要环节，干热处理简单易行，效果好。细胞染色体显示和分带技术三、常用染色体显带法1显Q带法 （1）将标本片于pH6.0缓冲液中浸510分钟后，再转浸入用Soresen氏缓冲液(pH6.0)配制的0.2%

10、的QD或QM染液中染色510分钟(见表1231)。（2）用pH6.0的磷酸缓冲液漂洗2次，每次5分钟，于玻片上滴加12滴新鲜缓冲液，加盖片。（3）在荧光显微镜下观察。2促染色体分散措施三、常用染色体显带法表12-3-1 Soresen(100ml)缓冲液PHNa2HPO4(1/15mol/L)kH2PO4(1/15m0l/L)pHNa2HPO4(1/15mol/L)kH2HPO4(1/15mol/L) 5.292.597.56.8150505.595956.9860405.9110907.1770306.2420807.3880206.4736747.7390106.6440608.04955

11、表12-3-1 Soresen(100ml)缓冲液Na22胰酶一Giemsa显G带法(1)将中期染色体标本于6080烘箱中烘24小时或过夜，然后再浸入0.025m磷酸缓冲液中(pH6.8)，56温浴10分钟后，用现配的胰酶一Giemsa混合液消化和染色1030分钟，染色后用自来水冲洗，再用蒸馏水漂洗数次，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。(2)将标本放于4080烤箱中数小时或更长，用0.25%胰蛋白酶热消化715分钟，并不断轻轻摆动玻片，水洗后再用Giemsa染液染510分钟，用自来水冲洗，蒸馏水漂洗，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。2胰酶一Giemsa显G带法3显C带法将中

12、期染色体玻片先投入预热至65的5%Ba(OH)2液中15分钟，取出玻片用自来水冲洗后，再将玻片投入预热至65的2SCC液中1小时10分钟，待自来水冲洗后再过pH7.4磷酸冲液，用Giemsa染色15分钟后镜检。 5%Ba(OH)2称Ba(OH)22.5g溶于50mL生理盐水中。必须注意胰蛋白酶消化显带过程中，消化不足，带不出现。消化过度，染色体变得膨胀和不着色。要注意胰蛋白酶浓度和消化时间。预处理或老化是显带的重要环节，干热处理简单易行，效果好。（见书后照片6）3显C带法将中期染色体玻片先投入预热至65的5%Ba(末梢血培养法，Giemsa染色分带法显示人染色体末梢血培养法，人染色体G带人染色

13、体G带慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞PH染色体核型慢性粒细胞白血病患者四、姐妹染色单体分化染色(一)原理细胞被培养在含有5溴脱氧尿苷(5Bromode Oxyurdine;BUdR)的培养基中，当细胞DNA合成时，BUdR取代胸腺嘧啶核苷(Thymidine.TdR)进入细胞增殖周期，第一周期每条染色单体DNA双链都被BUdR掺入(TB、TB)，第二周期只有一条单体保留了无BUdR旧链，另一条单体双链都有BUdR(TB、TB)，经荧光染料着色时TB有强荧光，BB荧光弱。四、姐妹染色单体分化染色(一)原理目前，Q、G和C三种带型较为常用，其中G带更为多用。将中期染色体玻片先投入预热至65的5%Ba

14、(OH)2液中15分钟，取出玻片用自来水冲洗后，再将玻片投入预热至65的2SCC液中1小时10分钟，待自来水冲洗后再过pH7.（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。染色（1）Giemsa染色 （2）用荧光染料Hoechst33258染色女性X染色质 Barr氏体位于间期细胞核内面，呈三角形或半月形小体，易被碳酸复红或硫堇等染料着色0的磷酸缓冲液漂洗2次，每次5分钟，于玻片上滴加12滴新鲜缓冲液，加盖片。初代淋巴细胞常用有丝分裂源PHA、ConA等刺激细胞。（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。(2)将标本放于4080烤箱中数小时或更长，用0.细胞染色体显示和分带技术（2

15、）显带染色前要将标本加温预处理利于显带，预处理后的标本不必再老化。（优选）细胞染色体显示和分带技术男性Y染色质 盐酸阿的平染色法消化过度，染色体变得膨胀和不着色。横行走向的带(Band)经特殊染色后，易着色的阳性带(Positive Band)为含有AT多的染色体节段，相反，GC多的则不易着色，为阴性带(Negative Band)。第三节 染色体结构显示和检测（2）显带染色前要将标本加温预处理利于显带，预处理后的标本不必再老化。二、染色体显带方法要点方法秋水仙素 低渗固定染色镜检（1）标本片应先放置一段时间，称“老化”处理，以310天为宜。男性Y染色质 盐酸阿的平染色法2%的QD或QM染液中

16、染色510分钟(见表1231)。要注意胰蛋白酶浓度和消化时间。（1）低渗处理 一般用0.将中期染色体玻片先投入预热至65的5%Ba(OH)2液中15分钟，取出玻片用自来水冲洗后，再将玻片投入预热至65的2SCC液中1小时10分钟，待自来水冲洗后再过pH7.根据显带方法不同可分为用奎吖因(QM)、阿的平(QD)荧光染色的带，称“Q”带；细胞被培养在含有5溴脱氧尿苷(5Bromode Oxyurdine;BUdR)的培养基中，当细胞DNA合成时，BUdR取代胸腺嘧啶核苷(Thymidine.人们推测，看家基因在阴性区带，人染色体能显示出近2000个G带。二、染色体显带方法要点（3）胰蛋白酶消化较好(比用NaOH、尿素等好)。横行走向的带(Band)经特殊染色后，易着色的阳性带(Positive Band)为含有AT多的染色体节段，相反，GC多的则不易着色，为阴性带(Negative Band)。有报道，已被定位的正常基因和异常基因绝大部分都在阴性带区。25%胰蛋白酶热消化715分钟，并不断轻轻摆动玻片，水洗后再用Giemsa染液染510分钟，用自来水冲洗，蒸馏水漂洗，凉干，二甲苯透明23分钟，封入中性树脂中。目前，Q、G和C三种带型较为常用，其中G带更为