SDS-PAGE检测重组蛋白

1、 SDS检测重组蛋白一、实验目的 = 1 * GB3 掌握SDS的基本原理； = 2 * GB3 掌握SSDS-PAGGE的凝凝胶制备备方法； = 3 * GB3 掌握蛋蛋白质的的考马斯斯亮蓝染染色法； = 4 * GB3 掌握测测定重组组蛋白分分子量的的方法。二、实验原原理：1、聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳（PAAGE）聚丙烯酰胺胺凝胶电电泳（ppolyyacrrylaamidde ggel eleectrrophhoreesiss），简简称PAAGE，是是以聚丙丙烯酰胺胺凝胶作作为支持持介质。聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶是由单单体的丙丙烯酰胺胺（accryllamiide）和和甲叉双双丙烯酰酰胺（bb

2、isaacryylammidee）聚合合而成，这这一聚合合过程需需要有自自由基催催化完成成。催化化剂过硫硫酸铵（AAP）可可产生自自由基，而而加速剂剂四甲基基乙二胺胺（TEEMEDD）可催催化过硫硫酸铵加加速自由由基的产产生，这这样就可可以形成成丙烯酰酰胺长链链，同时时甲叉双双丙烯酰酰胺在不不断延长长的丙烯烯酰胺链链间形成成甲叉键键交联，从从而形成成交联的的三维网网状结构构。氧气气对自由由基有清清除的作作用，在在制备聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶时通常常要进行行抽气，或或者用水水或正丁丁醇隔绝绝氧气。聚丙烯酰胺胺凝胶的的孔径可可以通过过改变丙丙烯酰胺胺和甲叉叉双丙烯烯酰胺单单体的浓浓度来控控制，丙丙烯酰

3、胺胺的浓度度可以在在3330%（VV/V）之之间。低低浓度的的凝胶具具有较大大的孔径径，如33%（VV/V）的的聚丙烯烯酰胺凝凝胶对蛋蛋白质没没有明显显的阻碍碍作用，可可用于SSDS-PAGGE的浓浓缩胶，也也可以用用于分离离DNAA。高浓浓度凝胶胶具有较较小的孔孔径，对对蛋白质质有分子子筛的作作用，可可以用于于根据蛋蛋白质的的分子量量进行分分离的电电泳中，如如1020%（V/V）的的凝胶常常用于SSDS-PAGGE的分分离胶。聚丙烯酰胺胺凝胶具具有以下下突出的的优点：（1）可可以随意意控制胶胶浓度和和交联度度，从而而得到不不同的有有效孔径径，用于于分离不不同分子子量的生生物大分分子；（22）

4、能把把分子筛筛作用和和电荷效效应结合合在同一一方法中中，达到到更高的的灵敏度度：100-9110-112 mmol/L；（33）由于于聚丙烯烯酰胺凝凝胶是由由-C-C-键键结合的的酰胺多多聚物，侧侧链只有有不活泼泼的酰胺胺基-CCO-NNH2-，没没有带电电的其他他离子基基团，化化学惰性性好，电电泳时不不会产生生“电渗”；（44）由于于可以制制得高纯纯度的单单体原料料，因而而电泳分分离的重重复性好好；（55）透明明度好，便便于照相相、扫描描或复印印。机械械强度好好，有弹弹性，不不容易破破碎，便便于操作作和保存存；（66）无紫紫外吸收收，不需需染色就就可以用用于紫外外波长的的凝胶扫扫描作定定量分

5、析析；（77）还可可以用作作固定化化酶的惰惰性载体体。聚丙烯酰胺胺凝胶分分离蛋白白质最初初是在玻玻璃管中中进行的的，后来来发展起起来的垂垂直平板板电泳一一次最多多可以容容纳200多个样样品，电电泳过程程中样品品所处的的条件比比较一致致，样品品间可以以进行更更好的比比较，重重复性也也更好，所所以垂直直平板电电泳目前前应用得得最更为为广泛，常常用于蛋蛋白质的的分离和和分子量量的测定定，以及及DNAA序列分分析过程程中的DDNA片片段的分分离和鉴鉴定。2、SDSS-PAAGE十二烷基硫硫酸钠-聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳（SDDS-PPAGEE）是根根据SDDS和还还原剂将将蛋白质质分子解解聚后亚亚基的

6、大大小，在在恒定ppH（碱碱性）缓缓冲体系系中的分分离。主主要用于于测定蛋蛋白质亚亚基的分分子量。与与超速离离心、凝凝胶过滤滤相比，SSDS-PAGGE不需需要昂贵贵的仪器器设备，操操作简便便，能在在几个小小时内得得到结果果，有较较高的重重复性，且且不需要要非常纯纯的样品品，是目目前为大大家所接接受的用用于测定定亚基的的分子量量的一种种最好的的方法。这这个方法法可用于于多肽分分子量的的分析，或或用于变变性蛋白白的分离离等。SDS是一一种阴离离子去污污剂，作作为变性性剂和助助溶剂，能能断裂分分子内和和分子间间的氢键键，使分分子去折折叠，破破坏蛋白白质分子子的二级级结构和和三级结结构。强强还原剂剂

7、，如-巯基基乙醇、二二硫苏糖糖醇（DDTT）则则能使半半胱氨酸酸残基之之间的二二硫键断断裂。在在样品和和凝胶中中加入SSDS和和还原剂剂后，在在1000加热35分钟钟，分子子被解聚聚为组成成它们的的多肽链链。解聚聚后的氨氨基酸侧侧链与SSDS充充分结合合形成带带负电荷荷的蛋白白质-SSDS胶胶束，所所带的负负电荷大大大超过过了蛋白白质分子子原有的的电荷量量，这就就消除了了不同分分子之间间原有的的电荷差差异。因因此，结结合了SSDS的的蛋白质质可以在在聚丙烯烯酰胺凝凝胶中向向正极泳泳动，同同时由于于聚丙烯烯酰胺凝凝胶的分分子筛效效应，蛋蛋白质在在凝胶中中的迁移移率主要要决定于于自身分分子量的的大

8、小，即即分子量量小的蛋蛋白质分分子通过过凝胶孔孔的阻力力小，迁迁移快，而而分子量量大的蛋蛋白质分分子通过过凝胶孔孔的阻力力大，迁迁移慢。SDS-PPAGEE分离不不同蛋白白质时的的高分辨辨率，不不仅是因因为聚丙丙烯酰胺胺凝胶介介质本身身的特点点，还归归功于在在电泳时时采用了了不连续续系统。不不连续系系统对样样品具有有浓缩效效应，从从而提高高了分离离效果。（1）凝胶胶层的不不连续。浓浓缩胶的的孔径大大，分离离胶孔径径小，在在电场的的作用下下，蛋白白质颗粒粒在大孔孔胶中泳泳动时遇遇到的阻阻力小，移移动快，而而在小孔孔胶中移移动慢。因因而在两两层凝胶胶交界处处，由于于凝胶孔孔径的不不连续性性，使样样

9、品迁移移受阻，而而压缩成成很窄的的区带。（2）缓冲冲液离子子成分及及pH的的不连续续。在两两层凝胶胶中均有有Triis（三三羟甲基基氨基甲甲烷）及及HCll。Trris的的作用是是维持溶溶液的电电中性及及pH值值，是缓缓冲配对对离子，HHCl在在任何ppH值溶溶液中均均易解离离出Cll-（氯离离子），它它在电场场中迁移移率大，走走在最前前面，故故称为快快离子或或前导离离子。电电极缓冲冲液中的的Glyy（甘氨氨酸）在在pH66.8的的缓冲体体系中解解离度很很小，仅仅0.11-1%，因而而在电场场中迁移移率很小小，称为为慢离子子或尾随随离子。蛋蛋白质-SDSS复合物物带有负负电荷，在在pH66.8

10、的的浓缩胶胶中，向向正极泳泳动，迁迁移率介介于快慢慢离子之之间，于于是蛋白白质就在在快慢离离子间形形成的界界面处，被被浓缩成成极窄的的区带。当当蛋白质质进入ppH8.8的分分离胶中中，Glly的解解离度增增加，其其迁移率率就超过过蛋白质质，因此此氯离子子和甘氨氨酸离子子沿着离离子界面面继续前前进。蛋蛋白质由由于分子子量大，被被留在后后面，然然后分成成多个区区带，因因此浓缩缩胶与分分离胶之之间pHH值的不不连续性性，能控控制迁移移率：在在浓缩胶胶中，要要求慢离离子较所所有被分分离样品品的有效效迁移率率低，以以使样品品在快慢慢界面之之间被浓浓缩；进进入分离离胶后，慢慢离子的的有效迁迁移率比比所有样

11、样品的有有效迁移移率高，使使样品不不再受离离子界面面的影响响。（3）电位位梯度的的不连续续。电位位梯度的的高低与与电泳速速度的快快慢有关关（V=mE）。电电泳开始始后，由由于快离离子迁移移率大，就就会很快快超过蛋蛋白质，在在快离子子后面形形成一个个离子浓浓度低的的区域即即低电导导区，有有较高的的电位梯梯度，使使蛋白质质和慢离离子在快快离子后后面加速速泳动。当当三者的的迁移率率与电位位梯度的的乘积彼彼此相等等时，三三者的泳泳动速度度就相等等。在快快慢离子子的移动动速度相相等的稳稳态建立立后，二二者之间间形成一一个稳定定而又不不断向阳阳极移动动的界面面，而蛋蛋白质的的有效迁迁移率在在快慢离离子之间

12、间，因此此也就聚聚集在这这个移动动附近，被被压缩成成一个狭狭小的中中间层。3、蛋白质质（亚基基）分子子量的测测定蛋白质-SSDS胶胶束在水水溶液中中的形态态，就像像一个长长椭圆棒棒，椭圆圆棒的短短轴对不不同的蛋蛋白质亚亚基-SSDS胶胶束而言言，基本本上都是是相同的的，约为为1.88 nmm。但长长轴的长长度则与与亚基分分子量的的大小成成正比。因因此这种种胶束在在进行SSDS-PAGGE时，电电泳迁移移率不再再受到蛋蛋白质原原有电荷荷的影响响，而主主要取决决于椭圆圆棒的长长轴长度度，即取取决于蛋蛋白质或或亚基分分子量的的大小。当当蛋白质质亚基的的分子量量在1552000 kkDa之之间时，电电

13、泳迁移移率与分分子量的的对数呈呈线性关关系。由由此可见见，SDDS-PPAGEE不仅可可以分离离蛋白质质，而且且可以根根据迁移移率大小小测定蛋蛋白质亚亚基的分分子量。蛋蛋白质或或亚基分分子量的的测定，可可根据蛋蛋白质标标准（蛋蛋白质MMarkker）测测定，或或根据相相对迁移移率进而而更精确确地测定定分子量量。现在市售的的蛋白质质Marrkerr大多是是由一系系列纯化化的、具具有不同同分子量量的蛋白白质组成成的，它它们之间间不会发发生相互互作用，在在进行SSDS-PAGGE时具具有良好好的线性性关系。例例如本实实验中采采用的低低分子量量蛋白质质Marrkerr为BBBI公司司产品，由由磷酸酶酶

14、b（兔兔子肌肉肉）、牛牛血清蛋蛋白（牛牛）、卵卵清蛋白白（鸡蛋蛋白）、碳碳酸苷酶酶（牛）、溶溶菌酶（鸡鸡蛋白）五五种蛋白白质组成成，其分分子量依依次为997.44 kDD，666.2 kD，442.77 kDD，311.0 kD，114.44 kDD。在电电泳时，将将蛋白质质Marrkerr点入与与样品相相邻的泳泳道，其其各蛋白白质组分分将在电电泳过程程中相互互分离。根根据分子子量相近近的蛋白白质具有有相近的的迁移率率这一原原则，可可以借助助于蛋白白质Maarkeer初步步确定目目的蛋白白的分子子量。为为了在电电泳时即即时观察察蛋白质质的分离离情况，还还可以采采用已经经经过着着色的蛋蛋白质MM

15、arkker，通通常称为为“彩虹”蛋白质质Marrkerr。另外，我们们还可以以根据蛋蛋白质MMarkker中中各种蛋蛋白质的的相对迁迁移率，作作出标准准曲线，从从而更精精确地测测定目的的蛋白的的分子量量。蛋白白质的迁迁移距离离，即从从分离胶胶的上沿沿至蛋白白带的中中央的距距离，可可以用直直尺直接接测得，而而蛋白质质的相对对迁移率率Rf是用每每个蛋白白带的迁迁移距离离除以溴溴酚蓝的的迁移距距离得到到，即：Rf = 蛋白带带的迁移移距离/溴酚蓝蓝的迁移移距离如果凝胶厚厚度大于于1mmm，由于于染色、脱脱色和保保存过程程中凝胶胶的膨胀胀或收缩缩，所以以必须测测量固定定前和干干燥后的的凝胶的的尺寸来

16、来消除这这种误差差，其公公式为：Rf =（蛋蛋白带的的迁移距距离/干干燥后的的凝胶长长度）（固定定前的凝凝胶长度度/溴酚酚蓝的迁迁移距离离）用每个标准准蛋白的的分子量量的对数数（纵坐坐标）对对它的相相对迁移移率（横横坐标）作作图就能能得到一一条直线线。量出出目的蛋蛋白的迁迁移距离离，计算算出相对对迁移率率，就可可以根据据标准曲曲线计算算出其分分子量。不不同，这这样的标标准曲线线只对同同一块凝凝胶上的的样品的的分子量量的测定定才具有有可靠性性。此外，使用用凝胶扫扫描或影影像文件件处理系系统，便便可以很很快读出出目的蛋蛋白的分分子量。三、实验材材料1、生物材材料 经经IPTTG诱导导的含有有重组质

17、质粒pEET288a-egffp，ppET228a-rfpp或pETT28aa-Dvgsst的基因工工程菌的的总蛋白白（由实实验二获获得）。2、主要试试剂（1）用于于SDSS-PAAGE凝凝胶的制制备：330%丙丙烯酰胺胺凝胶母母液（丙丙烯酰胺胺:双甲甲叉丙烯烯酰胺=29:1），220%SSDS，1.5 M Tris-HCl（pH6.8），1.0 M Tris-HCl（pH8.8），10%过硫酸铵（AP），四甲基乙二胺（TEMED），去离子水；（2）用于于SDSS-PAAGE凝凝胶的电电泳：11Triis-甘甘氨酸电电泳缓冲冲液；（3）用于于SDSS-PAAGE凝凝胶的考考马斯亮亮蓝染色色：甲

18、醇醇，乙酸酸，考马马斯亮蓝蓝；（4）用于于SDSS-PAAGE凝凝胶的硝硝酸银染染色：乙乙醇，乙乙酸，乙乙酸钠，25%戊二醛醛，硫代硫硫酸钠，硝酸银，甲醛，碳酸钠，EDTA-Na22H2O。3、主要仪仪器玻璃制胶板板，垂直直电泳槽槽，电泳泳仪，染染色与脱脱色摇床床，凝胶胶成像系系统。四、实验步步骤1、SDSS-PAAGE凝凝胶的制制备（1）正确确安装制制胶板，用用琼脂糖糖凝胶密密封底部部及侧面面，以免PPAGEE胶液泄泄漏。（2）在1150mml三角角瓶中配配置800ml 12%分离胶胶，混匀匀，沿玻玻璃板边边缘缓缓缓加入制制胶槽，加加至距梳梳齿约11cm处，留出浓浓缩胶的的空间。12%分离离

19、胶（880mll）：226.88ml H2O，322.0mml 330%凝凝胶母液液，200.0ml 1.55M TTriss（pHH8.88），00.4 ml 20%SDSS，0.8 mml 110%AAP，32l TTEMEED。注意：丙烯烯酰胺具具有一定定的神经经毒性，操操作时戴戴一次性性手套；加入凝凝胶时动动作要轻轻缓，以以免产生生气泡。（3）用11ml移移液器轻轻轻加入入适量去去离子水水作为覆覆盖层静静置约330miin使凝凝胶完全全聚合。注意：水作作为覆盖盖层可使凝胶胶表面变变得平整整，并可可防止氧氧气对凝凝胶聚合合反应的的抑制作作用。（4）倒出出覆盖层层中的水水，去离离子水洗洗涤

20、凝胶胶顶部数数次，以以去除未未参与聚合合反应的的丙烯酰酰胺，用用纸巾吸吸尽残留留液体。（5）在1150mml三角角瓶中配配置40mll 5%浓缩胶胶，混匀匀，轻轻轻加在分分离胶上上面，插插入梳子子，静置置约300minn，使凝胶胶完全聚聚合。5%浓缩胶胶（400ml）：27.4mll H22O，6.8mll 300%凝胶胶母液，55.0mml 1.00M TTriss（pHH 6.88），00.2mml 220%SSDS，00.6mml 110%AAP，224ll TEEMEDD。注意：加入入浓缩胶胶时动作作要轻缓缓，以免免产生气气泡；插插入梳子子时避免免在梳齿齿下方产产生气泡泡。（8）在垂垂

21、直电泳泳槽中加加入1Triis-甘甘氨酸电电泳缓冲冲液，轻轻轻拔出出梳子，用用滴管或或移液器器轻轻冲冲洗加样样孔，去除未未聚合的的丙烯酰酰胺，并并用细针针拨直凝凝胶齿。1Triis-甘甘氨酸电电泳缓冲冲液：225mM Trris，250mmM甘氨酸酸，0.1% SDSS。2、点样与与电泳（1）点样样：在加加样孔中中依次加加入155l样品：0h、11h、22h、33h、44h，并并在样品品的相邻邻泳道点点入蛋白白质Maarkeer。（2）电泳泳：接通通电源，起起始电压压80VV；当染染料前沿沿进入分分离胶后后，提高高电压至至1200V，电电泳约22-5hh。（3）待溴溴酚蓝前前沿到达达电泳槽槽底

22、部时时，切断断电源，戴手套取出玻璃板，小心从玻璃板上剥下凝胶以免破损，弃除浓缩胶，在分离胶右下角切去一小片，作为定位标记。3、考马斯斯亮蓝染染色与脱脱色（1）将分分离胶放放入染色色液，置置摇床上上缓慢摇摇动，染染色4hh以上或或过夜。染色液：990mll甲醇:水（11:1），110mll乙酸，0.25g考马斯亮蓝。注意：戴一一次性手手套操作作，以免免手上染染色。（2）取出出分离胶胶，用蒸蒸馏水漂漂洗数次次，将胶胶放入脱脱色液，置置摇床上上缓慢摇摇动2-4小时时，直至至背景蓝蓝色褪淡淡，见到到条带，期期间应更更换脱色色液3-4次。脱色液：990mll甲醇:水（11:1），110mll乙酸。注意：

23、戴一一次性手手套操作作，以免免手上染染色；回回收染色色液，可可反复使使用多次次。（3）测量量蛋白质质Marrkerr中各蛋蛋白质、溴溴酚蓝、重重组蛋白白质的迁迁移距离离，计算算它们的的相对迁迁移率RRf，利用用蛋白质质Marrkerr中各蛋蛋白质的的相对迁迁移率RRf和各蛋蛋白质的的分子量量作标准准曲线，并并根据该该标准曲曲线推算算重组蛋蛋白的分分子量。4、硝酸银银染色（1）固定定：配制制固定液液（5000 mml乙醇醇，1000乙酸酸，4000mll ddd H22O），处处理至少少30mmin。（2）浸泡泡：配制制浸泡液液（755ml乙乙醇，117g乙乙酸钠，11.255ml 25% 戊二二醛，00.5gg硫代硫硫酸钠，用用dd H2O溶解解后加至至2500ml），浸浸泡300 miin。（3）漂洗洗：用ddd HH2O漂洗洗三次，每每次5mmin。（4）银染染：配制制银染液（0.25gg硝酸银银，500l甲醛醛，用ddd H22O溶解解后加至至2500ml），染染色200 miin。（5）显色色：配制制显色液液（6.25gg碳酸钠钠，255l甲醛醛，用ddd