一种适宜春兰快速增殖培养基组合物及其方法

1、说明书说明书llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll一种适宜春兰快速增殖培养基组合物及其方法技术领域本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及兰科植物春兰组培苗的优化培养基配方及其快速繁殖方法。背景技术春兰（），别名小叶青，属兰科植物，分布于中国江苏、浙江、湖北、贵州、四川、广东、福建等省，主要产地在大盘山、天目山，是名贵珍稀濒危药用植物资源，性寒，味淡；清肺止咳，治支气管炎，解毒消肿，活血止痛，软坚散结；外用治毒蛇咬伤，痈疖疮疡；另外，斑叶兰叶片十分美丽，可作观赏植物栽培，十分精美，有宝石兰之称。由于其用途广泛、药效显著，经药农大肆采掘，已处于濒

2、危境地。春兰种子构造非常简单，极其细小似灰尘，人们至今还没有发现比它更小的种子，没有胚乳，只有薄薄的一层种皮和少数供自己生长、发育需要的养料，所以它的生命力很弱，极易夭折，用这些种子来繁衍后代，几乎是不可能的。斑叶兰在自然界一般靠无性繁殖，但繁殖率很低，加上人为肆意采挖，故已濒临灭绝。兰科植物应用植物组织培养技术进行快速育苗，已有成功的例子，如大花蕙兰、蝴蝶兰等，大花蕙兰主要是利用其腋芽多的特点进行腋芽组培获得成功，蝴蝶兰主要采用无菌播种技术，再经原球茎分化幼苗途径大量获得试管苗。但大家知道，兰科植物组培经原球茎分化幼苗途径存在种性易分化，后代不整齐，和多一道原球茎增殖环节，延长一个繁殖阶段（

3、3045天），增加了生产成本。斑叶兰虽属兰科植物，但至今尚未见有组培成功的报道；斑叶兰从种子结构到植株生长发育对光、温、水、肥、气均有一定的要求，所以无论是组OIBi培育苗还是组培苗移栽，如何摸索创造条件以满足斑叶兰植物对上述因子的特定要求，是组培成功的关键。发明内容本发明目的是克服以上存在不足，提出一种适于春兰组织培养的优化培养基配方；本发明的另一目的是提出春兰应用该配方进行快速、低成本繁殖组培优质苗的方法。本发明提出的适于春兰组织培养的优化培养基，由基本培养基及分别适用于不同组培阶段的培养基组成，各培养基添加物含量为：基本培养基：选用MS培养基或改良MS培养基(1/2MS),该培养基蔗糖或

4、白糖2030g/L,琼脂79g/L,pH为5.06.0；诱导培养基：MS+6-BA2.05.0mg/L+NAA0.10.5mg/L或IBA0.10.5mg/L；增殖培养基：MS+6-BA2.05.0mg/L+NAA0.10.5mg/L或IBA0.10.5mg/L；壮苗培养基：MS+6-BA0.22.0mg/L+NAA0.10.5mg/L或IBA0.10.5mg/L；)生根培养基：MS或1/2MS+IBA0.10.5mg/L和NAA0.10.5mg/L及活性碳1g/L中的任意一种、二种或三种的混合物。所述斑叶兰优化组培培养基，其基本培养基与各阶段培养基添加物含量为：1)基本培养基：MS或1/2M

5、S,其中蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.4；2)诱导培养基：MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.5mg/L；)增殖培养基：MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L；)壮苗培养基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；)生根培养基：1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+活性碳1g/L；斑叶兰应用上述组培培养基进行快速组培繁殖的方法，包括如下步骤：1)外植体的选取与灭菌：取斑叶兰茎尖、茎段、叶柄、叶片或根，经灭菌处理后备用；诱导培养：在无菌条件下将外植体切段或切片接种在诱导培养基上，经30天左右直接从外植体诱导出初代幼芽或丛芽；增殖培养：在无菌条

6、件下将初代幼芽或丛芽接种在增殖培养基上，培养3045天分化出大量继代幼芽或丛芽；壮苗培养：将继代幼芽或丛芽接种到壮苗培养基中，约30天后，幼苗长高、叶片长大，株高和叶面积可增加35倍。生根培养：将生长达25厘米的继代幼芽或丛芽接种到生根培养基中，约2030天后，幼苗基部长出数根根系；组培苗的驯化与移栽：将生长达37厘米以上的培养瓶生根幼芽苗或丛芽苗，移至常温下适应35天后，打开盖子再适应35天，洗清根部培养基后移栽入树皮碎块或其它基质中。本发明的有益效果是：1)提出的斑叶兰组培优化培养基针对性强、适用性好，由于提高了细胞分裂素浓度，芽的诱导率达90%以上；芽的增殖率每个培养周期达35倍，年组培

7、苗生产能力可达100万苗以上(一年为8个培养周期)；经增设的壮苗培养基培养后成苗生长速度加快，2030天苗高可达25厘米，生根率达100%；移栽成活率90%以上；OIBi2),该方法由于提高了细胞分裂素浓度并加强前期光照量，促使从外植体快速直接诱导出幼芽或丛芽，达到了仅采用少量外植体材料，即能实现大批量扩繁斑叶兰的目的，可有效地挽救珍稀濒危植物；同时缩短了组培周期(约3040天)，降低了生产成本25%左右，并保证了斑叶兰组培苗的种性纯度质量。3)斑叶兰组培苗大量繁殖，可实行规模化生产，推动斑叶兰种植业大力发展，促进以斑叶兰原料为依托的药品、保健食品、观赏花卉等相关产业发展。具体实施方式通过以下

8、实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。实施例1(适于斑叶兰组织培养的培养基1)基本培养基：选用MS培养基、其中蔗糖为20g/L，琼脂为9g/L，pH5.0；诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L；增殖培养基为MS+6-BA5.0mg/L+IBA0.1mg/L；壮苗培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；生根培养基为MS+IBA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+活性碳1g/L；实施例2(适于斑叶兰组织培养的培养基2)基本培养基选用改良MS培养基(1/2MS)，白糖为30g/L，琼脂为8g/L，pH6.0；诱导培养基为1/2M

9、S+6-BA5.0mg/L+IBA0.4mg/L；增殖培养基为1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L；壮苗培养基为1/2MS+6-BA0.5mg/L+IBA0.3mg/L；说明书说明书说明书说明书)生根培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L+NAA0.3mg/L；实施例3(适于斑叶兰组织培养的优化培养基)1)基本培养基：选用MS或1/2MS培养基、其中蔗糖为30g/L,琼脂为7g/L,pH5.4；诱导培养基为MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.5mg/L；增殖培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L；壮苗培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.

10、1mg/L；5)生根培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+活性碳1g/L；实施例4(斑叶兰组培快速繁殖方法)组培基本培养基和各阶段培养基配方同于实施例3，在无菌环境下，培养条件为：温度2028,光强15002500LuX,光照时间1012h/d；其中诱导培养和增殖培养两阶段，改常规兰科植物用散射光培养为2000LuX以上的光照进行培养；外植体的处理与灭菌：采用斑叶兰优良单株的茎尖、茎段、叶柄、叶片或根,用洗涤剂和自来水冲洗干净后，经75%酒精浸泡0.51.0min,再用0.1%升汞溶液灭菌1015min,或用2%的次氯酸钠水溶液灭菌1015min,然后用无菌水冲洗35次，再将外植体切段或切片接种在诱导培养基上；诱导培养：经30天左右,直接从外植体诱导出初代幼芽或丛芽；4)增殖培养：将初代幼芽或丛芽接种在增殖培养基上培养3045天，分化大量继代幼芽或丛芽；。5)壮苗培养：将继代幼芽或丛芽接种到壮苗培养基中培养约30天后,幼苗加OIBi速长高、叶片长大，株高和叶面积可增加35倍；6）生根培养：当继代幼芽或丛芽生长达25厘米时接种到生根培养基中，2030天后幼苗基部长出根系；7）组培苗驯化、移栽：当组培苗生长达37厘米以上，长出发达根系时，将培养瓶移到常温下放置3天左右进行驯化，再打开瓶盖，3天后取出组培苗，洗去根部培养基