苦参碱诱导大鼠肝星状细胞凋亡的体外研究

1、苦参碱诱导大鼠肝星状细胞凋亡的体外研究【摘要】目的研究苦参碱对体外培养的大鼠肝星状细胞系rHS-99凋亡的影响，并讨论其机制。方法体外培养rHS-99，随机分成4组：对照组(A组)，苦参碱0.12g/kg组(B组)，苦参碱0.24g/kg组(组)，苦参碱0.48g/kg组(D组)。苦参碱作用24h后，TUNEL法检测rHS-99凋亡，半定量RT-PR方法及免疫细胞化学方法检测rHS-99中神经生长因子(NGF)，p75及aspase-3的表达情况。结果不同浓度的苦参碱干预rHS-9924h后，rHS-99凋亡率随苦参碱的浓度增大而增高，D组凋亡率最高(P0.01);NGF，p75，aspase

2、-3RNA及其蛋白表达随苦参碱的浓度加大而表达升高，组表达最高(P0.01)。结论苦参碱可诱导HSs凋亡。激活NGF/p75通路、上调aspase-3蛋白表达可能是苦参碱诱导肝星状细胞凋亡的机制之一。【关键词】苦参碱;星形细胞;肝硬化;细胞凋亡;神经生长因子类;神经组织蛋白质类;基因表达肝纤维化是慢性肝病开展为肝硬化的中间环节，肝星状细胞(hepatistellateells，HS)的活化在此过程中起关键作用。近来研究说明，逆转肝纤维化关键在于减少活化型HS的数量，而凋亡是减少活化型HS数量的主要途径1。已发现苦参碱能诱导大鼠肝星状细胞凋亡2。本实验观察苦参碱对体外培养的HS凋亡的影响，并讨论

3、其可能的机制。1材料和方法1.1材料大鼠肝星状细胞系rHS-99系保持体外培养激活的HS特性3;苦参碱注射液(斯巴特康，广州明兴制药，10g/L，每支5L，批号：D2101-2);RPI1640培养基胰酶新生牛血清(美国Gib公司);NGF多抗及免疫细胞组化SAB试剂盒(武汉博士德公司);逆转录试剂盒、Taq酶、DNAarke(美国BI公司);总RNA提取试剂Trizl(美国Invitrgin公司);原位细胞死亡检测试剂盒(北京中山生物技术);引物由上海生工生物合成。1.2方法1.2.1rHS-99细胞培养含10%新生牛血清的RPI1640培养液、37、体积分数为0.05的2培养箱中培养，隔天

4、换液，待细胞长至80%密度时，用0.25%胰蛋白酶消化，按14传代。1.2.2分组取生长良好的rHS-99，48孔板(免疫细胞化学法和TUNEL检测)或6孔板(RT-PR检测)。培养24h后再用无血清的RPI1640液培养24h，随机分为：对照组(加PBS，A组);苦参碱0.12g/L组(B组);苦参碱0.24g/L组(组);苦参碱0.48g/L组(D组)。药物作用24h后，分别进展形态学观察及以下各项检测。1.2.3TUNEL法检测HS的凋亡各组均设3个复孔。按TUNEL试剂盒说明书操作。1.2.4RT-PR检测NGF，p75，aspase-3的RNA表达0.25%胰酶消化并离心搜集细胞。按

5、Trizl法提取总RNA，逆转成DNA。PR反响体系25L：10buffer2.5L，2l/LdNTP2.5L，gL21.5L(25l/L)，dna2L，Taq酶0.625U，-atin上下游引物各0.5L(10pl/L)，p75或NGF或aspase-3上下游引物(表1)各0.5L(10pl/L)，去离子水补足至25L。反响条件：95预变性5in，进入热循环：95变性45s57退火45s72延伸50s，28个循环，最后一个循环后72继续延伸10in。取8L产物加溴酚兰2L混合后经2%琼脂糖凝胶电泳，图象分析仪扫描得出峰值，半定量分析，以p75/-atin、NGF/-atin、aspase-3

6、/-atin作为其RNA表达量。1.2.5免疫细胞化学法检测NGF，p75，aspase-3蛋白表达各组均设3个复孔，按SAB试剂盒说明进展操作。显微镜下观察着棕黄色的为表达阳性细胞(凋亡细胞)，摄片。免疫细胞化学实验结果采用H-sre法评分法分析。1.3统计学处理数据以xs表示，采用SPSS11.5软件系统分析，单因素方差分析检验，Kruskal-allisH检验比拟凋亡率。福建医科大学学报2022年11月第43卷第6期翁山耕等：苦参碱诱导大鼠肝星状细胞凋亡的体外研究表1引物序列2结果2.1形态学观察培养的rHS-99在苦参碱作用后细胞形态发生明显改变。对照组HS呈星形，芒状突起丰富，高倍镜

7、下细胞核呈圆形或不规那么形，核仁圆形，明晰可见。苦参碱作用组较对照组细胞明显减少，细胞间隙较宽，细胞呈圆形，细胞内出现大量空泡，随苦参碱浓度增加，上述改变愈加明显(图1)。A:空白对照组;B：苦参碱作用组.2.2TUNEL法检测HS的凋亡A，B，D组HS凋亡率为(0.760.35)%，(4.421.59)%，(7.831.60)%，(15.921.57)%。B，D组与A组比拟，差异具有统计学意义(H=17.86，P0.01)。D组HS凋亡率最高(图2)。光镜下细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞.A：对照组;B：0.12g/L苦参碱组;：0.24g/L苦参碱组;D：0.48g/L苦参碱

8、组.2.3RT-PR法检测NGF，p75，aspase-3RNA表达2.3.1RT-PR检测NGFRNA表达B，D组NGFRNA表达分别为(0.4090.074)，(0.7240.109)，(0.5600.104)，与A组(0.2910.086)比拟，差异有统计学意义(F=83.908，P0.01)。组NGFRNA表达最高(图3A)。2.3.2RT-PR检测p75RNA表达B，D组p75RNA表达分别为(0.1560.028)，(0.5620.097)，(0.1900.079)。与A组(0.0790.016)比拟，差异有统计学意义(F=231.776，P0.01)。组p75RNA表达最高(图3

9、B)。2.3.3RT-PR检测aspase-3RNA表达B，D组aspase-3RNA表达分别为(0.3580.065)，(1.0510.113)，(0.6610.072)。与A组(0.3580.065)比拟，差异有统计学意义(F=126.271，P0.01)。组aspase-3RNA表达最高(图3)。2.4免疫细胞化学法检测NGF，p75，aspase-3蛋白表达2.4.1NGF蛋白表达NGF在细胞质表达，细胞质呈着棕黄色染色的为阳性细胞。A，B，D组NGF蛋白表达分别为(1.7500.156)，(2.1400.186)，(2.8100.198)，(1.8500.149)。与A组比拟，B，D

10、组的NGF蛋白表达增加，差异有统计学意义(F=68.724，P0.01)。组NGF表达最强(图4A)。2.4.2p75蛋白表达p75在细胞核表达，细胞核呈着棕黄色染色的为阳性细胞。A，B，D组p75蛋白表达分别为(1.7100.157)，(2.2100.170)，A：NGF(神经生长因子)RNA;B：p75RNA;：aspase-3RNA;：-atin，225bp;：NGF，467bp;：p75，386bp;：aspase-3，342bp;A：空白对照组;B：0.12g/L苦参碱组;：0.24g/L苦参碱组;D：0.48g/L苦参碱组;：arker.转贴于论文联盟.ll.A:NGF蛋白表达，细

11、胞质呈着棕黄色染色的为阳性细胞;B：p75蛋白表达，细胞核呈着棕黄色染色的为阳性细胞;：aspase-3蛋白表达，细胞质呈着棕黄色染色的为阳性细胞.(2.7300.988)，(1.9800.146)。与A组比拟，B，D组的p75蛋白表达增加，差异有统计学意义(F=5.574，P0.01)。组p75表达最强(图4B)。2.4.3aspase-3蛋白表达aspase-3在细胞质表达，细胞质呈着棕黄色染色的为阳性细胞。A，B，D组aspase-3蛋白表达分别为(0.8500.102)，(1.9100.158)，(2.6100.189)，(2.3500.176)。与A组比拟，B，D组的aspase-3

12、表达增加，差异有统计学意义(F=98.757，P0.01)。组aspase-3表达最强(图4)。3讨论肝纤维化是慢性肝病开展为肝硬化的中间环节，是一个多环节的发生开展过程。其中HS的活化在此过程中起关键作用。研究说明，逆转肝纤维化关键在于减少活化型HS的数量，而凋亡是减少活化型HS数量的主要途径1。防治肝纤维化缺乏有效方法。近年发现苦参碱等某些中草药具有抗肝纤维化作用，成为研究热点。在既往研究中发现苦参碱能诱导大鼠肝星状细胞凋亡2，但其机制不明。HS的凋亡可通过Fas/FasL、TRAIL/TRAILR、NGF/p75、线粒体途径等多种途径来介导。NGF是一种小分子多肽，与动物的神经细胞的生长

13、、分化和凋亡相关。NGF有高亲和力受体trkA和低亲和力受体p75两种受体4，其中p75是一种糖蛋白，属肿瘤坏死因子受体超家族成员。NGF与trkA结合后促进神经细胞的生长和存活，与p75结合却诱导神经细胞凋亡。p75介导的凋亡过程与多种、激酶有关。其中丝裂原相关的蛋白激酶、JNK、aspase等起着重要作用5。Tri等发现，活化型HS能表达p75，而静止型HS以及肝脏中的其他细胞成分都不表达p75;NGF与活化型HS外表p75结合后，导致HS凋亡6。David等发现人与大鼠的肝细胞可检测出TrkARNA，而HS表达p75及NGF7。以上证据显示p75/NGF途径是一条有选择性的HS凋亡途径，

14、它可以选择性促进活化型HS凋亡，而肝细胞却不受损害，这可能是机体在肝脏受损时对抗肝纤维化一种有效保护措施，也将成为逆转肝纤维化治疗的一种策略。本实验结果显示，随着苦参碱浓度增加，凋亡率升高，且在苦参碱浓度为0.48g/L时升至顶峰，证实苦参碱具有诱导HS凋亡的作用，与田雄英的报道相符2。本实验还证实HS能表达NGF及其受体p757。实验发现，各实验组的NGF、p75、aspase-3的RNA和蛋白表达都随着苦参碱浓度增大而增强，在苦参碱浓度为0.24g/L时到达顶峰。在正常情况下，aspase-3蛋白是以活性很低的酶原形式合成，包括氨基酸原域、大亚单位(约20KD)、小亚单位(约10KD)组成

15、，通过蛋白酶水解去除氨基酸的一段序列而被激活。本实验免疫组织化学所用的抗体是特异地针对aspase-3活化后酶解的P20亚单位，结果显示空白对照组中aspase-3表达不明显，说明在正常体外培养的无干预的HS中，aspase-3是以活性很低的酶原形式存在。在低浓度的苦参碱作用后aspase-3便开场大量表达，可见aspase-3与HS凋亡的亲密相关。以上结果提示，苦参碱可能是通过NGF/p75途径，上调aspase-3的表达诱导HS凋亡。本组实验中，HS的凋亡顶峰却在0.48g/L时发生，与NGF、p75、aspase-3的表达不同步。说明信号转导启动至凋亡的发生存在时间差。苦参碱促进HS凋亡

16、的机制极为复杂，其间可能有多条信号转导途径参予，有待进一步讨论。【参考文献】1Ken1Y,Paik1Y,ShnablB,etal.Glitxin-ediatedapptsisfativatedhuanhepatistellateellsJ.JHepatlgy,2022,39(4):38-46.2田雄英,翁山耕,林永堃,等.苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖和凋亡的影响J.肝脏,2022,10(2):95-97.3冷希圣,翁山耕,李涛,等.大鼠肝星状细胞系的建立及其生物学特性的研究J.解剖学报,2022,34(3):272-277.4Niederhauser,angld,ShubenelR,etal.NGFLigandAltersNGFSignalingViap75(NTR)andTrkAJ.JNeursiRes,2000,61(4):263-272.5EggertA,SievertsH,IkegakiN,etal.p75ediatedapptsisinneurblastaellsisinhibitedbyexpressinfTrkAJ.edPediatrnl,2000,35(3):573-576.6TriJE,SaraSK,ArthurJ,etal.UpstreatissueinhibitrfetallprtEinases-1(TIP-1)e