(完整)丙型肝炎病毒核酸定量检测作业指导书

1、完整丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导PAGE PAGE 6/9（生效日期：目的丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书采用 PCR技术、实时荧光探针技术, 用于临床血清或血浆标本中的丙型肝炎病毒核酸的定性检测， 适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断.范围适用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。3。 职责3。1 操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。专业组组长作。实验室主任负责监督和指导实验室各方面工作.4。 原理采用荧光 技术，以丙型肝炎病毒基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针， , 根据阈循环值现对

2、未知样本的检测。另外，本试剂盒带有内标物质, 用于对核酸提取的整个过程进行监控, 减少假阴性结果的出现。5。 样本要求5.1 适用标本类型：血清5。2 标本采集用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血 2 ml注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂） 室温（223060min 血标本可自发完全凝集析出血清5min吸取上层血清， 1.5ml 灭菌离心管。5.3 标本保存和运送所采集的标本可立即用于测试或长期保存于 70，也可保存于20待测，保存期为 3 个月, 标本应避免反复冻融. 标本运送采用干冰（或者冰袋）保持低温，运输时间不应超过 4 天。5。4 拒收标本: 拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆.6。

3、仪器和试剂设备AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。试剂生产厂家：中ft大学达安基因股份有限公司产品标准批号： YZB/国7271 2013最低检出量：最低检出量为 500 IU/ml试剂各组分见表 1：表 1试剂盒组分表组分名称规 格数 量RNA提取液 A200 ul/ 管1核酸提取试剂RNA提取液 B5 ml/ 瓶2DEPC H2O3 ml/ 瓶1HCV内标溶液100 ul/ 管1PCR 检测试剂HCV反应液 A270 ul/ 管1HCV反应液 B30 ul/ 管1阴性质控品200 ul/ 管1质控品HCV强阳性质控品200 ul/ 管1HCV临界阳性质控品200

4、ul/ 管17。 操作步骤7。1 试剂准备( 试剂储存和准备区）。1 记录。反应液配制7.1。2.1取出反应液、反应液室温溶化后振荡混匀，8000rpm离心数秒后使用.7。122取出 N个（N =待测样本数+ 4 个阳性定量标准品+强阳性质控品+临界阳性质控品阴性质控品空白孔反应管组分A组分AB总体积用量/ 人份27330将各组分充分混匀，混合好后进行短时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将 30 扩增体系分装到PCR反应管, 反应液分装时尽量避免产生气泡, 盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区.75乙醇配制:取225l的PC，加入6。75l的无水乙醇, 振荡混匀，配制成7乙醇，盖紧盖子，经

5、传递窗传递到标本制备区。7。2 RNA提取（标本制备区）7。2.1进入标本制备区，从传递窗中取出反应管和75乙醇，放入标本制备区冰箱冷藏。、B和内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。65，使仪器自动升温。72.4 n 5 = 待测样本数3 = 待测样本数强阳性质控品临界阳性质控品阴性质控品）7。2。5 向离心管中各加入10 内标溶液，再分别加入200ul 样本，800 提取液盖紧管盖，振荡混匀15s 以充分混匀，室温放置5min（每隔1min旋涡振荡5s, 使裂解更充分，处理结束后瞬时离心.） 7。2.6加入200 无水乙醇,盖紧管盖，漩涡振荡混匀15s 以充分混匀,瞬时离心，再加入20提液

6、漩涡振荡混匀5s，室温静置1min.8000rpm 离心1min，小心吸弃上清。727再加入200lA提取液，盖紧管盖，充分混匀(用移液枪吹打，室温下8000rm 离心1i,小心吸弃上清。7。2.8 加预冷的75400ul 充分混匀,8000rpm 1min，小心吸弃上清。7。2.9 加预冷的75400ul 充分混匀，8000rpm1min，小心吸弃上清.7.2.10打开管盖，放入金属浴，655min，使液体挥发完全.。11 温育5min 后，用镊子从金属浴中取出离心管，加入 50DEPCH 用移液枪吹打混匀，室温静置1min后rpm离心离心管内的上清液即为病毒核酸溶液,建议立即使用如需保存置

7、于-707。2.13取出已分装好的 反应管，向对应编号的 管中加入处理好的的样品(包括待测标本、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品)上清液各 20 空白对照不加模板，盖紧反应管。8000rpm离心数秒, 经传递窗移至扩增检测区。（用移液枪小心吸取上清液，尽量不要碰到底层沉淀。）扩增（扩增区)反应管，放入仪器样品槽内。7.3。2 在“ Set 按对应顺序设置空白管、阴性质控品、阳性室内质控品、临界阳性质控品、阳性定量参考品及待测标本，并在slee 一栏中设置样本名称 , 探针检测模式设置：eortere1 ：，Dye1:none ；Reporter Reference法参考75007.3.

8、3打开“ Method”50 15min ，1个循环；95 5min，1个循环；9415s5545s（收集荧光 个循环；7。3.4保存文件，运行仪器。8。 结果分析体设置方1 Baseline 315，End 520Log 值，使阈值线位于扩增曲线指数期, 调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线。点击 Report 界面查看结果，记录样本数值（8.2 检测通道无明显对数增长期品的 V 阴性。3如果反应体系扩增曲线在C检测通道均有对数增长期且检测通道45;或者扩增曲线在检测通道有对数增长期且45，在C检测通道无对数增长期, 则判定样品的V阳性性。9. 质量控制每次实验均需检测阴性质控品、 HC

9、V强阳性质控品、HCV临界阳性质控品。质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判断.9。1 试剂盒自带质控(1 ）检测通道扩增曲线有明显对数增长期。（2)HCV30，临界阳性质控品 FAM检测通道 36。(3) 阳性定量参考品：增长曲线呈 S 型曲线，且 0。97 r 1。9。2 室内质控每次实验应选择适当的V质控品做室内质控。9.3 以上要求(9.1 。2需在同一次实验中同时满足，否则本次试验无效，需从新进行。10。 干扰因素1。1环境中存在 s，可降解 ，导致实验结果假阴性, 实验用品需高压灭菌后使用, 尽量避免污染.临床标本中内源性抑制物: 血红蛋白、免疫球蛋白、白细胞内乳铁蛋白、

10、脂类、等都可抑制 标本应避免溶血、脂血、黄疸等.外源性抑制物: 应按采集要求采集，操作中应小心谨慎，标本容器及实验用具应鉴定合格。, 防止交叉污染, 尽量使用带鉴定合格的滤芯吸头, 应与标本一起提取, 以及时发现交叉污染.1。 生物参考区间1010 2/l10 10 8/l12. 警示/V检测无警示/危急值。13。 异常结果处理检测结果与临床诊断或资料, 通，查找原因并采取措施，于疑问报告发放处理记录表中记录处理过程 . 如需复查，需及时保存标本。14. 临床意义HCV感染诊断的指标，指导临床治疗。15。 变异的潜在来源标本保存不当或反复冻融，都会影响检测结果的准确。16。 注意事项。1 实验

11、过程中必须穿专用工作服、戴手套、口罩、帽子、必要时戴防护眼罩，接触标本后必须及时更换手套。2 阳性质控品和检测样本均应视为具有传染性物质，应避免接触到皮肤和粘膜。16.3实验过程必须严格分区操作，各区物品均为专用，不得交叉使用。4 样品的处理操作应在生物安全柜内进行。16。5 所用检测试剂使用前应完全解冻，瞬时离心后使用，应避免反复冻融。6 否则请保存于20(24 ) 。7 操作过程中应防止交叉污染，尽量使用鉴定合格的滤芯吸头，阴性对照品应与标本一起提取。16。8 加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，尽快盖紧管盖。上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。16.9并与废物一起灭菌后方可丢弃。10 , 丢弃于指定地点。11 10次氯酸钠的废物缸内，