发酵设计链霉菌生产维生素B12

1、发酵设计链霉菌生产维生素 B12中北大学 2021 年发酵工程课程设计说明书1 绪论维生素 B12 是一种水溶性维生素。只需少量即能产生效果， 为 深红色结晶或结晶粉末又称为红色维生素(red vitamin)或氰钻胺。 维生素 B12 具有广泛的生理作用，它参与体内甲基转换及叶酸代谢， 促进神经髓鞘中脂蛋白的形成，保持中枢神经和外周髓鞘神经纤维的 功能完整，参与广泛的蛋白质及脂肪代谢等。其计量单位为微克(mcgmicrogram，即1 /*-*克)。现在维生素 B12 的发酵常用菌种为放线菌中的链霉菌。链霉菌的简介链霉菌-链霉菌属(streptomyces),其基内菌丝多分枝，一般横 隔稀疏

2、，很少断裂，常产生各种水溶性或脂溶性的色素；气生菌丝比 基内菌丝稍粗,为外鞘所包,气生菌丝部分分化成直形、柔曲、钩环 状至松敞或紧密螺旋形的孢子丝,时常含 50 个左右的孢子,短者含 510个抱子。本属菌种数最多，分类鉴定比较困难，一般认为抱子 丝的形状、孢子的表面结构、孢子的颜色和在有机培养基内是否产生 类黑色素是最主要的分类指征。它们在土壤中分布极广，大多在人工 培养基上生长茂盛，少数是植物致病菌。因许多种是抗生素的产生菌 而且产生抗生素的种类最多而著名(如链霉素)。在维生素 B12 发酵 中，我们采用国内比较常用的灰色链霉菌及其变种。灰色链霉素的抱 子柄直而短，不呈螺旋。抱子量多，呈椭圆

3、球形。气生菌丝和抱子都 呈白色，单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直径3-4mm。基质 菌丝透明，在斜面背后产生淡棕色色素。菌种采用沙土管或冷冻干燥 保藏。维生素 B12 结构与性质维生素B12 (VB12)为钻胺素(Cobalamin)类化合物，它的分 子中有 4 个还原性吡咯环联结在一起，这种构叫做咕啉，它与核苷酸 （二甲基苯异咪唑）及核糖第1页中北大学 2021 年发酵工程课程设计说明书相联，另一方面与D-1-氨基-2-丙醇相连，钻与核苷酸之N相偶 联。化学上称氰钻胺素为维生素B12，除CN后称钻胺至少。CN可 为其他基团代替，成为不同类型的钴胺素。一般称对哺乳类有生理作 用的为钻胺素，

4、称对哺乳类及微生物都有作用的为维生素B12。本文 中维生素 B12 泛称此类物。氰钴胺至少自然界很少，为人工合成产品，可从其他类型转换而 来。它是红色结晶，其活力为重金属及氧化还原剂所破坏，但在短期 高压消毒（12C。）不被破坏，能溶解在1： 80水中，溶液为中性，在 pH4.55时最稳定。辅酶B12 （即5-脱氧腺钳钻胺素）及甲基B12 （甲基钻胺素）为 哺乳类（人类）组织中最主要的辅酶形式。前者在线粒体内，后者在 胞浆内，为合成蛋氨酸所必需者。它们对光不稳定，光解后形成水钴 胺素。在氰存在下变成氰钴胺素，维生素 B12、B12a、B12b、B12c 都 可治疗维生素 B12 的缺乏。氰钴胺

5、素分子式（ CN 可以其他基团代替 ）1.2.1 维生素 B12 主要功能1）提高叶酸利用率，与叶酸一起合成甲硫氨酸（由高半胱胺选 合成）和胆碱，产生嘌呤和嘧啶的过程中合成氰钴胺申基先驱物质如 甲基钻胺和辅酶B12,参与许多重要化合物的甲基化过程。维生素B12 缺乏时，从甲基四氢叶酸上转移甲基基团的活动减少，使叶酸变成不 能利用的形式，导致叶酸缺乏症。第2页中北大学 2021 年发酵工程课程设计说明书2）维护神经髓鞘的代谢与功能。缺乏维生素 B12 时，可引起神 经障碍、脊髓变性，并可引起严重的精神症状。维生素 B12 缺乏可导 致周围神经炎。小孩缺乏维生素 B12 的早期表现是情绪异常、表情

6、呆 滞、反应迟钝，最后导致贫血。3）促进红细胞的发育和成熟。将甲基丙二酰辅酶 A 转化成琥珀 酰辅酶A,参与三羧酸循环，其中琥珀酰辅酶A与血红素的合成有 关。4）参与脱氧核酸（DNA ）的合成，脂肪、碳水化合物及蛋白质 的代谢，增加核酸与蛋白质的合成。维生素 B12 主要用途（ 1 ）医疗方面用于治疗和预防维生素 B12 缺乏症。用于胃切除或吸收不良综合症,维生素B12缺乏造成贫血的预 防。用于补充因消耗性疾病，甲状腺机能亢进，妊娠，哺乳等造 成的维生素 B12 需求增加。肝障碍贫血。放射性引起的白细胞减少。神经疼，肌肉疼，关节疼。 末梢神经炎，末梢神经麻痹。脊髓炎，脊髓变性。（2）饲料添加

7、剂维生素 B12 对于机体生长是一种不可缺少的微量营养物质，大多 数动物的植物性饲料中不含维生素B12,动物一方面靠胃肠中的微生 物合成，一方面靠外界添加。为了满足动物维生素的需要就必须补充 维生素添加剂。猪和鸡等非反刍动物缺乏维生素 B12 主要表现是生长发育停滞， 也有少数猪可出现轻度的正常红细胞性贫血。此外，还可使鸡的孵化 率和猪的生殖率降低。缺乏症的临床症状包括食欲不振、生长停滞、 单纯贫血，严重的也有神经症状。饲料维生素 B12 能促进家禽，特别是幼禽幼畜的生长发育。 可 用于：第3页中北大学 2021 年发酵工程课程设计说明书维生素 B12 缺乏所引起的猪、鸡生长发育不良和贫血；

8、缺 钻地区牛、羊所出现的地方性消瘦病；神经炎、神经痛等的非特 异性治疗； 提高饲料蛋白的利用率； 经济动物的饲养；用 B12 溶液处理鱼卵或鱼苗，可提高鱼对水中有毒物质如苯和 重金属的耐受力。 （3）其它食品添加剂可作为仪器着色剂：如火腿，香肠，冰淇淋，鱼肉酱。用于化妆品，肥皂，牙膏等，也可用于厕所，冰箱，口腔等防 臭，消除硫化物和醛的气味。维生素 B12 的发酵生产（一）抗生素废液中提取早在 1952 年美国 T.R.Wood 等人就发现,当用加有钴化合物的培 养基培养灰色链霉菌时,可大大提高维生素 B12 在整个培养液中的浓 度,但是对于钴化合物的浓度要求要适量,过高的浓度会对菌体细胞产

9、生毒性;另有研究表明,添加适量的氰化合物也同样可促进抗生素废液 中 B12 类似物的含量,但需严格掌握其用量。（二）放线菌发酵 自从人们发现可从抗生素废液中提取得到维生素 B12 后,许多科 学家将目光转向了采用放线菌,其中主要是运用链霉菌属中的灰色链 霉菌和橄榄色链霉菌来发酵产维生素B12，由于链霉素的生成，而始终 未能使得维生素 B12 的产生处于主导地位,因此,我们应选出链霉素发 酵支路的关键酶,并将其抑制,这样便可大大提高维生素 B12 的得率,使 得大量产生维生素 B12 成为可能。发酵法生产维生素 B12 的生产路线：第4页中北大学 2021 年发酵工程课程设计说明书维生素 B12 的提取对于维生素 B12 提取,不断有新的方法提出,主要有两种,一种为溶 剂提取法,另一种为离子交换树脂法。（一）有机溶剂提取 研究表明,采用两相混合溶剂,可简单地纯化和提取出来,常用的溶 剂为苯甲醇和水的混合溶液，基本过程如下:发酵液一吸附（活性碳）一 洗脱（吡啶）一浓缩一层析（AI2O3）洗脱（甲醇）一收集红色液一浓缩一 结晶。（二）离子交换树脂法 离子交换树脂法提取随着离子交换柱在工业上的广泛应用 ,人们 尝试用阴阳离子交换树脂来进行维生素 B12 的提取,并取得了较好的 效果，过程如下所示:发酵液一阳离子树脂（LonacC-240