HMGB2沉默对乳腺癌MDA3f231细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响

1、_临床肿瘤学杂志2 0 17年1月第 2 2卷第1期_ChineseClin icalO ncology,Ja n.20 17,Vol.22,No.l1论 著HMGB2沉默对乳腺癌MDA-MB-2 3 1细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响*刘爱1蕙0 0,0 0李6秀北楠京，王首钢都乐医，科唐大 学欣附，属董北 京懿妇，产纪医院楠乳，腺康科 骅2【摘 要】 目的 探讨HMGB2沉默对乳腺癌MDA - MB-2 3 1细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响。方法 采 用将靶向HMGB2的寡核苷酸克隆至pLKO.1puro载体质粒构建靶向沉默HMGB2表达的慢病毒shRNA。 将MDA - MB-231细胞分

2、为对照组、空转染组及HMGB2干扰组，其中空转染组及HMGB2干扰组分别转染包含 随机序列shRNA和靶向HMGB2shRNA的病毒液，对照组仅行常规培养而不行任何转染。采用Wester n blotti ng检测各组转染48h后的HMGB2蛋白水平以评价转染效率，采用MTT法计算各组细胞的存活率， 流式细胞术检测转染4 8h后的细胞凋亡率，Tra nswel l法检测转染48h后的细胞侵袭和转移水平。结果 H MGB2干扰组的HMGB2蛋白水平低于对照组和空转染组，差异有统计学意义(P 0 0 5 )，提示构建的载体沉默 HMGB2的效果显著。与对照组和空转染组比较，HMGB2干扰组的细胞存

3、活率降低，且随着转染时间的延长而呈降 低趋势，差异均有统计学意义(P005) ;HMGB2干扰组细胞的早期、晚期及总凋亡率均高于其余两组，且侵袭 细胞数目和迁移细胞数目均低于其余两组，以上差异均有统计学意义(P 0 0 5 )。结论shRNA靶向沉默MDA -MB- 2 3 1细胞中HMGB2表 达效果显著，可抑制细胞增殖及侵袭迁移并诱导细胞凋亡，为乳腺癌靶向治疗提供一定参考。【关键词】乳腺癌；高迁移率族蛋白2(HMGB2);增殖；凋亡；侵袭；迁移中图分类号：R7379文献标识码：a 文章编号：1009-0460(2017)01-0001-05EffectsofHMGB2silencingon

4、proliferation,apopto sis,invasionandmigrationofbreastcancercelllin eMDA-MB-2 3 1LIUAihui,LIXiunan,WANGGangyue,TANGXin,DONGYi,JINan,KANGHua.DepartmentofBreastOncology,Be ijingObstetricsandGynecologyHospital,CapitalM edicalUniversity,Beijing100006,ChinaCorrespondingauthor:WANGGangyue,E-mail:gangy HYPE

5、RLINK mailto:ue_ ue_bre ast【cAa nbcsetrraccetl】l lin OeMbDecAti - vMeB - 2T3o1 .inMveestthigoadtse thTeheeffleecnttivoifraHlMveGcBto2rwsialsenccoinnsgtrounctepdrobliyfecrlaotnioinng，ta hpeoopltiogsoins，ucilneovtaisdieosntaarngdetminiggrHa tMioGnBo2fintopLKO.1purovector.MDA - MB - 231cellsweredivi de

6、dintocontrolgroup，emptytransfectiongroupandHMGB2int erferencegroup.Theemptytransfectiongroupwastransfecte dwithra ndomseque nceshRNAa ndHMGB2 in terfere ncegroupwast ran sfectedwithle ntiviralvectortargeti ngHMGB2shRNA.The controlgroupwastreatedwithroutineculturewithoutanytra nsfection.Westernblotti

7、ngwasusedtodetectthelevelofHMG B2prote in aftertra nsfecti onf or48h in eachgrouptoevaluate theefficiencyoftransfection.MTTmethodwasusedtocalcula tethesurvivalrateofeachgroup.Flowcytometrywasusedtode_临床肿瘤学杂志2 0 17年1月第 2 2卷第1期_ChineseClin icalO ncology,Ja n.20 17,Vol.22,No.l3tecttheapoptosisrateafter

8、tra nsfecti onf or48h.TheTra nsw ellmethodwasusedtodetectthe inv asi onan dmetastasisof48h aftertra nsfecti on. Results ThelevelofHMGB2prote inin the HMGB2 in terfere ncegroupwaslowertha nthose incon trolgroup an demptytra nsfecti on group,a ndthediffere ncewasstatisti callysig ni fica nt(P005) .Com

9、paredwithco ntrolgroupa ndem ptytransfectiongroup，thesurvivalrateofHMGB2interferen cegroupwasdecreased，andtherewasadecreasingtrendwithth ein creaseoftra nsfecti on time(P005) .Theearly,latea ndto talapoptosisratesofHMGB2interferencegroupwerehigherth an those in theothertwogroups,a ndthe nu mbero fin

10、v asivecell san dthe nu mberofonclusionmigrati ngcellswerelowertha ntheothertwogroups(P005). ConclusionSile ncin gHMGB2expressi onv iashRNA in MDA-MB-*基金项目：首都医科大学附属北京妇产医院中青年学科骨干培养专项资助项目(fcyy201530)通讯作者，E - mail: HYPERLINK mailto:gangyue_ gangyue_100050 首都医科大学宣武医院普外科2_临床肿瘤学杂志2 0 17年1月第2 2卷第1期_Chin es

11、eCli nicalO ncology,Ja n. 2017,Vol.22,No.1231cellshasasignificanteffect，caninhibitcellproliferation，invasion，migrationandinducecellapoptosis，toprovideareferenceforbreastcancertargetedtherapy.【Keywords】Breastcancer; High-mobilitygroupbox2(HMGB2); Proliferati on; Apoptosis; Inv asi on; Migrati on 高迁移率

12、族蛋白(high-mobilitH盒M特G征B)是讨H目MG前蛋在白哺家乳ygroupboX，族动之物一中，均发含现有的典4型个的HHMMGGB成员均含有两个2串。联HM的G基B1本和HMHMGG盒B结2均构为域高及度1个保长的酸性尾巴守子的与核其蛋对应白靶，作点为的染结色合质结。合近因年子来,发可现促H进M转GB录 n2因在多种恶4-5性。肿Sh瘤in中等过6表的达研，1 材料与方法11细胞和主要试剂 人乳腺癌MDA-MB-231细胞及包装细胞293T细胞株购自中科 院上海细胞库，胎牛血清购自英国Biochr om公司，细胞培养基D唑M盐E(M、胰蛋白转酶染脂购质自体美国Gibco公司T ,

13、 ”四2甲0 0 0基、偶pol氮V究如发胰现腺采癌用、黑基色因素技瘤术及沉乳MTT) Lipofectamine究如发胰现腺采癌用、黑基色因素技瘤术及沉乳默HMG B2表达可提高结直肠癌细胞株HCT -默HMG B2表达可提高结直肠癌细胞株HCT -凋亡检测试剂盒(AnnexinV-FITC/116和HT - 2 9对治疗的反应性，提示HMGB2在肿瘤的发生、发展中可能发挥重要作用。 但目前HMGB2在乳腺癌发生、发展中的作用 鲜有报告，故本研究将靶向H MGB2的shR PI)购自南京凯基生物公司，鼠抗HMGB2 抗体购自美国Abcam公司，兔抗GAPDH 抗体及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠/

14、兔二抗购自 美国SantaCruz公司，载体质粒pLK O.1puro、辅助质粒pCMV-dR82NA转染至MDA-MB-2 3 1细胞，dvpr和包膜质粒pCMV- VSV-G均购自美观察其对该细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响，现 国 Addgene 公司,AgeIsEcoR I将结果报告如下。限制性内切酶购自美国NewEnglandBiolabs公司,Matrigel基质胶购17,Vol.22,No.l自美国BD公司,BCA蛋白检测试剂盒购自北京碧云天公司,Transwell小室购自美国Corning公司。细胞培养将冻存的MDA-MB-2 3 1 细胞常规复苏重悬后，采用DMEM培养基进行

15、培养，补充体积分数10%胎牛血清、10 0U/ml青霉素和100 p g/ml链霉素，于37 C、5%CO 2及饱和湿度下培养，次日更换培养基1次，之后每3天换液1次。待细胞融合 度达8 0%9 0%时，取状态好的细胞用于后 续实验。载体构建 将靶向HMGB2的寡核苷酸 克隆至pLKO.1pur o载体质粒来构建靶 向沉默HMGB2表达的慢病毒shRNAH MGB2的寡核苷酸序列(5-GCAAAGGAGAAGTCGAAGTTTCTCGAGAAACTTCGACTTCTCCTTTGC- 3和5 - CCATCTGCCTTCTTCCTGTTTCTCGAGAAACAGGAAGAAGGCA-5G A T

16、 G G - 3 )由上海生工生物工程公司合成经Age I.EcoR I双酶切后，将HMGB 2的寡核苷酸序插入中将至，包16装pLh细K后O胞采.12用 p9u3rTo以载体3xo10在6后接TM续种 20慢于00病1将0毒02颗m93m粒T 培 包细养装胞中与皿Lipofectamine3 p gpLKO.1、26 p gpCMV - dR8 2dvpr 及03 p gpCMV- VSV-G 混匀转染48h后收集含病毒培养液，以150 0r/min离心5min后取上清经045 pm滤器过滤后，即得病毒原液并于-80 C 保存。14转染及实验分组 取对数生长期MDA-MB231细胞，加入8

17、pg/mlpolybr ene,取病毒原液进行转染。将MDA-MB-23 1细胞分为对照组、空转染组及HMGB2干 扰组，其中空转染组及HMGB2干扰组分别转染包含随机序列shRNA和靶向HMGB2ShRNA的病毒液，对照组仅行常规培养而不行 任何转染48h后采用1 pg/ml的嘌呤霉素 移除未感染的细胞。采用Westernblot t i n g检测H M G B 2水平以 评 价 转 染 效 率 。收15 Westernblotting 収 集各组转染48h的细胞，采用RIPA缓冲液（150mmol/LNaCl、20mmol/LTris - HCl、1mmol/LEGTA、 1mmol/L

18、EDTAs1%NP-40、1脱氧胆酸钠和蛋白酶抑制剂）裂解后进行快速超声处理。采用BCA蛋白检测试剂盒检 测蛋白水平后每个样本取5 0 pg上样。经10% SDS - PAGE处理后采用半干转法转膜后，加 入以1:2 0 0稀释处理的HMGB2抗后，4 C孵育过夜并加入二抗，洗膜后进行ECL显 影处理，采用IPP60分析软件计算各条带 的光密度后，以HMGB2条带与内参的比值表 示其相对表达量。1照6 1 x1细04胞个增/殖孔活的性密检度测接 种取至各9组6孔转板染中后，的每细 组胞3,个按复孔，分别于转染2 4、48和7 2h后每孔加入20 plMTT溶液（5g/L） 经4h培养后加入10

19、 0 pl二甲基亚砜终止反应 检测4 9 2 nm波长处的各孔吸光值（A）。根据 公式计算存活率：存活率（）二（对照组 A值-实验组A值/对照组A值）X100%。17流式细胞术检测 取各组转染48h后的细胞细，胞采浓用度预为冷1xP1B0S 6冲个洗/m2l。次取后1,0经0 p缓l至冲液5m重l悬培调养整管中,分别加入Annexi17,Vol.22,No.lnV- FITC 和PI各5 Ml,37 C 孵育15min后上机检测各组的凋亡率。1胞8进 行TrTanrasnwsewllel法l试检验测。迁收移集试各验组中转，染将4 5 8xh后个的细细10胞需加提入前无铺血设清M培atr养ige

20、基l胶的，上加室入，而1 x侵10袭个实细验胞中于接血种前清培养基的上室，下室均为含10胎牛血清的培养 基24h后取出小室，依次经甲醛固定及结晶 紫染色，采用倒置显微镜计算侵袭或迁移细胞数。 实验重复3次。19统计学分析 采用SPSS 2 0 0版软件处理数据。实验数据均以“ 均数标准差” 表 示，两组以上样本均数的比较采用单因素方差分 析，其中均数两两比较采用Student - Newman-Keuls法。以P0057为差异有统计学意义。2 结 果2 1转染后各组HMGB2蛋白的表达情况采用Westernblotting检测转染4 8h后的HMGB2蛋白水平发现,HMGB2干扰组的HMGB2

21、蛋白水平低于对照组和空 转染组，差异有统计学意义(P 0 0 5 )。见图1。22转染HMGB2shRNA对各组细胞增殖的影响采用MTT检测转染2 4、48、72h后MDA-MB-231图 1各组eMt水平D】ai MBg检测；1细胞BM相对表达量的表达细胞的增殖情况发现,HMGB2干扰组的细胞存 活率均低于对照组和空转染组，差异有统计学意 义(P 0 0 5 )。见图 2。图2 各组MDA-MB- 2 3 1细胞转染后的存 活曲线23 转染HMGB2shRNA对各组 细胞凋亡的影响 采用流式细胞仪检测转染48h 后MDA-MB-2 3 1细胞的凋亡情况，发现HM GB2干扰组的早期、晚期及总

22、凋亡率均高于对照1204S72处理时间组和空转染组，差异有统计学意义(P005)。24o二nd2. 见图3。2|4030 HMCB2 1社组广1广1门门|晚硼 总体流式制龍朮检测；肌澗亡节睨图3各组MDA-MB-2 3 1细胞转染后的凋亡情况临床肿瘤学杂志2 0 17年1月第2 2卷第1期 Chin eseCli nicalOncology,Ja n. 2017,V ol. 22,N o.124 转染HMGB2shRNA对各组细胞侵 袭的影响采用Transwell法检测转染4 8h后MDA-MB-231细胞的穿膜数量，发现HMGB2干扰组的侵袭数目低于对照组和空 转染组，差异有统计学意义(P

23、0 0 5 )。见图4。01I对郎组空转染组ll、K；E2TDt组A:Transw干01I对郎组空转染组ll、K；E2TDt组对照组；b：空转染组；c： *图 转染HMGB2shRNA对细胞侵袭的影响25转染HMGB2shRNA对各组细胞迁移的影响采用Transwell法检测转染4 8h后MDA-MB-231细胞的迁移数目，发现HMGB2干扰组的穿膜细胞数低于对照组和空转染组，差异有统计学意义(P 0 0 5 )。见图5。肘照组 空转染组 HMCE52 I-扰组A:Transw干el扰1法组检测；B:穿膜细胞数；a:对照组；b:空转染组；c: 图5 转染HMGB2shRNA对细胞迁移的影响3

24、讨 论HMGB2与HMGB1均为较为保守的HM G家族成员，目前对HMGB1与恶性肿瘤的研究 较为透彻，发现其在细胞分化、增殖及迁移侵袭过 程中发挥重要作用。在多种炎症状态下,HMGB 2可释放至胞外发挥作用，如可与晚期糖基化终末 产物受体结合7。HMGB2在胚胎发育过程中 的高表达，但在成人中主要在睾丸和淋巴器官中表 达8。缺失HMGB2不会导致小鼠死亡，但会造成雄性的生育能力降低。此外,HMGB2在关 节表面区域的软骨细胞中高表达，而敲除该基因后 小鼠极易发展为骨关节炎9。近年来发现HMGB2还参与了肿瘤发生、发展，如除在多种恶性肿 瘤中高表达外4 - 5 ,HMGB2过表达还与原发 性肝

25、细胞癌患者预后不良有关10。研究发现沉默 HMGB1可抑制乳腺癌细胞的增殖及侵袭迁移能 力11。鉴于HMGB2与HMGB1的功能区域 有重叠，且HMGB2在多种恶性肿瘤发生、发展 中起一定作用，本研究推测HMGB2对乳腺癌的 表明该载体系统安全有效，为后续研究HMGB2 的功能奠定基础。过度增殖是恶性肿瘤不易控制的主要原因12 本研究显示，转染2 472h,MDA-MB-2 3 1细胞的存活率均低于正常水平，表明沉默HM GB2可持续抑制乳腺癌细胞的增殖，可影响其生 长活性和增殖能力，在乳腺癌的防治上有一定应用 前景。HMGB2是一种DNA结合蛋白，其与D NA损伤诱导的细胞死亡关系密切“A瞬

26、时过表 达HMGB2后，细胞对顺铂诱导的细胞死亡产生抵抗14，且可降低足叶乙甙诱导的肝癌细胞凋亡性行为也有一定影响。15。据报道，包括HMGB2在内的多蛋白复合由于HMGB2在乳腺癌中高表达，故本研究物可识别摄入非天然核苷引起的DNA结构变化，选用载体质粒pLKO.1pur o手段下调HM进而影响细胞对化疗的敏感性。故沉默HMGB2GB2表达。本研究采用该载体体系成功地将靶向表达可影响识别异常DNA结构的多蛋白复合物功HMGB2 的shRNA 片段在 MDA-MB- 2 3 能降低，继而减少对DNA结构变化的识别作用，1细胞中过表达，主要表现为HMGB2干扰后的最终表现为细胞存活和增殖能力下降

27、。此外，本研HMGB2蛋白水平大幅降低，且转染随机序列s究进一步发现沉默HMGB2基因表达后，hRNA的细胞HMGB2蛋白与正常水平无差异，17,Vol.22,No.l11M调D节A乳-M腺B-癌2 3 1细细胞胞的的凋凋亡亡过率程增也加起，到表一明定H作MG用B2对以pCnuraocntleceieanrriRnreibsto,hne2u0cnl0ue6co,lpera6or6teCmin2a)trF:ix7,6a3as-nsod7c6i9aht.iegdhwmitohbicliotlyongrcoaunpcerboxJ1.上合证体结迁据构移表中和明侵起H袭关MG是键B肿作2在瘤用细。识胞别

28、的异重常要或生伤物损学D特NA性的16复。6 iS(nhHicnMolGYorBje,2c)tKalim mcoadnMucslea, rtecsKelirlmadJiMors.e,sCpaoenntcsaeelr.anBH相肿关瘤相肿关瘤，细也胞是的导迁致移治和疗侵失袭败能的力主与要乳原腺因癌。的晚预期后糖密基切化72 1 3 -22 1 .AminAexpressionR,ofHIsMlaGmanAdBS.100GAenfoammiiclyinanhaulymsiasnaarnthdritids:iffuepremegtiua - 1终激末活产细物胞受内体的可多与种晚信期号糖通基路化来终参

29、末与产肿物瘤结细合胞，的进而侵1atedexpressionofchemokines,IL - 8andniicoxidebyHMGB1袭迁移过程15 HMGB2可分泌至胞外，与晚期糖胞，的进而侵1atedexpressionofchemokines,IL - 8andniicoxidebyHMGB1袭迁移过程15 HMGB2可分泌至胞外，与晚期糖8 YJam.anDaNkAaYC,e11FBagioh1i,hi20MlA4,3M3a(g8is)tr:i5M5,0-e5t6a51基.AntisenseRNA化终末产物受体相结合，故其可能也参与了乳腺contro1sLRP1Senseranscr

30、iptexpressionthroughinteractionwith癌验细检胞测的发侵现袭H转MG移B过2下程调。后本， 研M究DA采-M用 B- T2r3a1ns 细we胞11实的91aLiece（h6rSo）（m：N9at6aimn7 - - aY9ss7,6Kc . ioaoteJdYp,roetteain1.,AHsMmaG1B12mo1Jecu.1eCeb1i1ndRinegp,HM20G1B51，侵的袭恶迁性移生能物力学受行抑为制有，关表。明本H研M究GB下2与步乳将腺重癌点细研胞NanadtCHhMemGBB2ioi1n,hi2b0i1ts4,mi1c0ro(g112ia)-

31、m:1e0d5ia5t-ed10n6e0u.roinf1ammation究沉默h17,Vol.22,No.l13MGB2对晚期糖基化终末产物受体相关信ri IV2DZ10 KwonJH,KimJ,ParkJY,etal.Overe pressionofhigh-号及中通侵HM路综袭G的迁上B2影移所蛋并响述白。,诱s的h导R表N细A达胞靶效凋向果亡沉显为默著乳M,可腺DA抑癌-m制靶B细-向2 3治1细疗提胞11 2NmpM0rioCo1bgPF0in,l - ,io7tsy1Zics6hge(arlolon2fuga2pp)hYoe:bpp,5otax5otLs1o2ii1csue-ials

32、5lYnu5ad,l s2asir1eon.tchciiaaabtrlie.ctdinHin owMvmiatGashiBot1nuJmasnoi.lrdenCamcglieegntraecssCotsuaaivslndiecsneperJrsosRm.aeoInsntdeteperJrsosRm.aeoInsntdet胞增殖供一定参考。本研究的结果将在动物实验上进行JClinExpPathol,2015,8(12 ):15940-15 9 4 6.验证。12林非梦小洁细，胞陈肺志癌强迁，移尹和凌侵帝袭，能等力的长影链响非编J码临R床NA肿H瘤O学TA杂IR志对，2014,19(8):684-689.2胰王活J国腺化中良腺的国，泡研兑老细究丹年胞J华学a，中杂nu任