氨肽酶抑制剂对全反式维甲酸诱导人急性早幼粒白血病细胞株NB4细

1、氨肽酶抑制剂对全反式维甲酸诱导人急性早幼粒白血病细胞株NB4细【摘要】为了研究氨肽酶抑制剂乌苯美司bestatin对全反式维甲酸ATRA诱导人APL细胞株NB4细胞分化作用的影响及其可能机制，NB4细胞经bestatin和ATRA单用或结合应用途理一定时间后，用光学显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测D11b表达，四氮唑蓝NBT复原实验检测分化细胞功能，RT-PR法检测-y和-EBPRNA表达，esternblt检测-y蛋白表达。结果显示：NB4细胞经100g/lbestatin和10nl/LATRA结合处理72小时后，其分化的形态更明显；100g/lbestatin与不同浓度ATRA结合处理7

2、2小时，能增强NB4细胞的NBT复原才能，与单用相应浓度ATRA组相比，差异显著P0.01；从48-96小时，100g/lbestatin能增强10nl/LATRA诱导NB4细胞的NBT复原才能，且呈时间依赖性，与相应时间点ATRA组相比，差异明显P0.01；与单用10nl/LATRA组相比，ATRA10l/L)和bestatin100g/l联用途理72小时，NB4细胞D11b阳性表达率明显增加P0.01；与单用10nl/LATRA组相比，联用100g/lbestatin处理4小时后，NB4细胞-yRNA表达的降低更明显P0.05；50、75、100g/lbestatin与10nl/LATRA

3、结合处理8小时后，NB4细胞-y蛋白表达程度明显降低，与单用ATRA组相比差异显著P0.05；药物联用各组NB4细胞-y蛋白表达程度与NBT复原才能之间呈负相关r=-0.940，p=0.017；与100g/lbestatin联用不能增强10nl/LATRA上调-EBPRNA的表达；50、75、100g/lbestatin单独处理对NB4细胞的分化无影响。结论：氨肽酶抑制剂bestatin可以增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用，这可能与bestatin协同ATRA下调-y的表达有关。【关键词】细胞株EffetfAinpeptidaseInhibitrnDifferentiatinInduti

4、nAtivityfAll-transRetiniAidinHuanAutePryelytiLeukeiaNB4ellsandItsehanisAbstratThisstudyaspurpsedtinvestigatehetherainpeptidaseinhibitr，bestatin，anptentiateall-transretiniaid(ATRA)-induingdifferentiatininNB4ells，andtexplreitsehanis.TheNB4ellsereexpsedtEitherbestatinandATRAalnerinbinatin，therphlgialha

5、ngesfNB4ellserebservedbyptialirspy，theD11bexpressinaseasuredbyflytetry，thefuntinfdefferentiatinellsasanalyzedbynitrblue-tetrazliu(NBT)redutinassay，theRNAexpressinsf-yand-EBPinNB4ellseredetetedbyRT-PR，the-yprteinexpressinasdeterinedbyesternblt.Theresultsshedthattreatentithbestatinalneinduednsignifian

6、thangesinrphlgy，NBTredutinativityandD11bexpressininNB4ells.NB4ellsinubatedith10nl/LATRAplus100g/lbestatinshedrerphlgifeaturefetayelyteandbandneutrphilthanATRAalnetreatedells.100g/lbestatinenhanedtheNBTredutinativityinNB4ellsinduedbyvariusnentratinsfATRA(10，20，40nl/L).TheeffetsfvariusnentratinsfATRAi

7、nbinatinith100g/lbestatinerestatistiallydifferentfrtheeffetfATRAalne(P0.01).Fr48t96hurs，100g/lbestatintie-dependentlyinreasedNBTredutininNB4ellsinduedby10nl/LATRA(P0.01).10nl/LATRAplus100g/lbestatinfr72hursprinentlyelevatedD11bexpressininNB4ellsasparedithATRAalnetreatedNB4ells(P0.01).Thereasasubstan

8、tialdereasein-yRNAlevelshen100g/lbestatinasaddedt10nl/LATRA(P0.05).Variusnentratins(50，75，100g/l)fbestatinbinedith10nl/LATRAdn-regulatedtheexpressinf-yprtein，hihasnegativelyrrelatediththeNBTredutinativityfNB4ellsinduedby10nl/LATRAalnerplusbestatinatvariusnentratins(r=-0.940，P=0.017).Hever，100g/lbest

9、atinplus10nl/LATRAuldntindueanysignifianthangesinthelevelsf-EBPRNAasparedithATRAalnetreatedNB4ells.ItisnludedthatanainpeptidaseinhibitrbestatinanptentiateATRA-induingdifferentiatinfNB4ells，pssiblybydn-regulating-yexpressininsynergyithATRA.Keyrdsbestatin;ATRA;ellline，NB4;differentiatin氨肽酶抑制剂乌苯美司besta

10、tin能抑制氨肽酶N/D13和亮氨酸氨基肽酶活性，通过增强宿主免疫功能及诱导肿瘤细胞凋亡等发挥抗肿瘤作用1，2。有研究提示，bestatin可以诱导U937细胞的分化1，国内未见报道。我们以NB4细胞为研究对象，通过形态、功能和外表分化抗原等多层次实验研究，理解bestatin是否能诱导NB4细胞分化及或对ATRA的诱导分化作用的增强效应，并初步讨论其可能的机理。材料和方法主要试剂Bestatin、ATRA均购于Siga公司。bestatin以无菌去离子水溶解为1g/l，分装之后-20保存；ATRA以无水乙醇溶解成10-5l/L的储存液，4避光保存，使用时用RPI1640细胞培养液将其稀释为相

11、应工作浓度。NBT为BBI公司产品，以PBS配成0.1%溶液，过滤除菌后4避光保存，使用前1周内配制。RPI1640为Gib公司产品。胎牛血清为JRH公司产品。D11b-FIT标记单克隆抗体为Teteh公司产品。D13-PE标记单克隆抗体为BetnDikinsn公司产品。TRIzL试剂为Gib公司产品，-LV逆转录酶和TaqDNA合成酶为Prega公司产品。鼠抗人-y单克隆抗体-33及羊抗人-Atin多克隆抗体I-19均为Santaruz公司产品，使用时以TBST液分别按1500和11000稀释。EL显色液为Santaruz公司产品。细胞培养及药物处理人APL细胞株NB4细胞浙江大学肿瘤研究所

12、惠赠及人髓细胞白血病细胞株HL-60细胞培养于含10%胎牛血清的RPI1640细胞培养液中，置37、5%2培养箱中培养，2-3天传代1次。实验时取对数生长期的细胞，调整细胞密度为7104/l，以不同浓度ATRA和bestatin单独或结合处理，于不同时间搜集细胞进展实验。细胞形态学观察取空白对照组及药物处理各组细胞悬液，离心，制备涂片，瑞氏-姬姆萨染色，用光学显微镜Leia，4010观察细胞形态。四氮唑蓝nitrblue-tetrazliu，NBT复原实验按文献3报道的方法进展。空白对照组及药物处理各组细胞与NBT共孵育后，制备涂片，瑞氏-姬姆萨染色，光学显微镜下10010观察，胞浆内含有蓝黑

13、色颗粒者为阳性细胞，随机计数200个细胞，计算阳性细胞百分率。细胞外表分化抗原D11b和D13的检测取对数生长期HL-60细胞和NB4细胞或药物处理后各组NB4细胞离心，用PBSpH7.4洗涤，调整细胞数为2105/50l，加D13-PE标记单克隆抗体8l或D11b-FIT标记单克隆抗体5l，避光孵育30分钟，用PBS洗涤，上流式细胞仪检测。以ellquest1.2软件进展分析。细胞总RNA提取和RT-PR反响总RNA提取用TRIzL一步法抽提细胞总RNA，按试剂说明书操作。甲醛变性凝胶电泳证实为完好RNA，紫外分光光度仪定量，A260n/280n比值均在1.8-2.0之间。逆转录反响样品总R

14、NA4g及随机引物0.5g，705分钟，立即冰浴，离心。依次加5逆转录酶缓冲液5l、10l/LdNTP1.25l、-LV200U，RNase抑制剂0.6l，DEP水补至反响体积为25l，于2710分钟，3760分钟，7210分钟灭活逆转录酶，冰浴1分钟，完毕反响。PR反响PR引物为上海Sangn公司合成。引物序列、反响条件及产物大小见表1。反响体系包括逆转录产物2l、10PR缓冲液2.5l、25l/Lgl21.5l、10l/LdNTP0.5l、25l/L(-y与-EBP)或2.5l/L(-atin)上游及下游引物各0.5l、TaqDNA聚合酶1U，用灭菌去离子水补至终体积为25l。预实验确定产

15、物与循环之间呈线性关系范围。取5l反响产物在15g/L琼脂糖凝胶含0.5g/l溴化乙锭电泳，电场强度5V/，紫外灯下观察电泳结果，用凝胶成像系统BI-RAD公司扫描分析条带灰度，以目的基因与-atin的灰度比做半定量分析。Table1.Sequenesfpriers，nditinfPRandsizesfPRprduts略esternblt搜集药物处理各组细胞细胞数为2106/l，预冷的PBS漂洗2次，重悬于100lLaiulis上样缓冲液0.125l/LTris-Hl，pH6.8，4%SDS，5%甘油中，超声波裂解，于4离心13000g15分钟，搜集上清，蛋白样品保存于-80。按蛋白定量试剂盒

16、Bi-Rad公司操作说明书进展蛋白定量，在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，转移后的硝酸纤维素膜以5%脱脂奶粉封闭1小时，分别与抗人-y和抗人-atin抗体及辣根过氧化酶标记的二抗孵育。EL显色，显影于胶片。图像分析处理系统IageStatin2000R扫描，测定条带的面积和灰度，以二者之乘积进展半定量比较分析。统计学分析处理各项实验重复3次以上，以XD表示，多组间比较F检验后采用方差分析及Tukey检验。相关分析采用Pearsn相关。应用SPSS10.0统计软件进展统计分析。结果NB4细胞外表有D13的表达NB4细胞D13阳性表达率为94.79%平均荧光强度为1739.59，对照组HL-60细

17、胞D13阳性表达率为95.49%平均荧光强度为3107.49。两者的D13平均荧光强度有一定的差异，但阳性百分率差异不明显。Bestatin与ATRA结合处理后NB4细胞形态改变明显100g/lbestatin单独作用72小时后，NB4细胞形态无明显改变。10nl/LATRA单独作用72小时后，NB4细胞呈现局部分化的形态，细胞核/浆比例减小，核变小有凹陷。100g/lbestatin与10nl/LATRA结合处理72小时后，NB4细胞形态分化更加明显，细胞浆内空泡增多，核凹陷、扭曲更加明显，形态似晚幼粒及杆状核粒细胞的细胞增多图1。Bestatin与ATRA结合应用后NB4细胞NBT复原才能

18、明显增加以一定浓度50、75和100g/lbestatin单独处理72小时后，NB4细胞的NBT复原才能无明显改变与空白对照组相比较，P0.05；不同浓度10、20和40nl/LATRA作用72小时后，NB4细胞的NBT复原才能呈浓度依赖性增加，与空白对照组相比，差异明显。100g/lbestatin与不同浓度ATRA结合处理72小时后，NB4细胞的NBT阳性率明显地进步，与单用相应浓度ATRA组相比，差异显著表2。Table2.EffetfbestatinntheNBTredutinativityfNB4ellsinduedbyATRA.(略)100g/lbestatin单独处理细胞不同时间

19、48小时-96小时，NB4细胞的NBT复原才能改变不明显与相应时间点空白对照组相比，P0.05；10nl/LATRA处理细胞至72小时，开场出现NB4细胞NBT复原才能的增强，并呈时间依赖性，与相应时间点对照组相比，有明显差异；而10nl/LATRA与100g/lbestatin结合处理48小时，就出现NB4细胞NBT复原才能的明显增强，且此作用随时间延长而明显增强，与相应时间点单用10nl/LATRA组相比，差异显著图2。Bestatin与ATRA结合处理后NB4细胞D11b表达明显增强100g/lbestatin单独处理72小时后，NB4细胞D11b阳性表达率FI为13.40.6稍有增加，

20、但与对照组FI为12.30.9相比，差异不显著P0.05。10nl/LATRA单独处理72小时之后，NB4细胞D11b阳性表达率FI为19.24.2明显进步，与对照组相比，差异显著P0.01；100g/lbestatin与10nl/LATRA结合处理72小时后，NB4细胞D11b阳性表达率FI为31.08.4的进步更加明显，与单用10nl/LATRA组相比，差异明显P0.01图3。Bestatin和ATRA单独及结合处理后NB4细胞-EBPRNA表达的变化NB4细胞低表达-EBPRNA。10nl/LATRA处理12小时之后，NB4细胞-EBPRNA表达程度明显进步，与对照组相比较，差异显著(P

21、0.01)；100g/lbestatin处理12小时之后，NB4细胞-EBPRNA的表达程度无明显变化；其与10nl/LATRA结合处理也未能增强ATRA上调-EBPRNA表达的作用表3。Table3.EffetsfbestatinandATRAnexpressinf-yRNAand-EBPRNAfNB4ells(略)Bestatin和ATRA单独及结合处理后NB4细胞-y表达的变化NB4细胞-yRNA呈高程度表达。10nl/LATRA单独处理4小时后，NB4细胞-yRNA表达下降，与空白对照组相比较，差异明显P0.05。100g/lbestatin单独处理4小时后，NB4细胞-yRNA表达程

22、度改变不明显；但100g/lbestatin与10nl/LATRA结合处理4小时后，NB4细胞-yRNA表达程度降低更明显，与单用ATRA组相比，差异显著P0.05图4，表3。Figure4.EffetfbestatinandATRAntheexpressinf-yRNAfNB4ellsaftertreatentfr4hurs.:arker;Lane1:ntrl.Lane2:bestatin(100g/l).Lane3:ATRA(10nl/L).Lane4:bestatin(100g/l)+ATRA(10nl/L).NB4细胞-y蛋白呈高表达。10nl/LATRA单独处理8小时后，NB4细胞-

23、y蛋白表达程度明显下降P0.01。50、75、100g/lbestatin分别单独处理8小时后，NB4细胞-y蛋白表达程度无明显改变；但50、75、100g/lbestatin均能与10nl/LATRA协同下调NB4细胞-y蛋白的表达程度，与单用ATRA组相比，差异有统计学意义P0.05图5。不同浓度0、50、75、100g/lbestatin与10nl/LATRA结合处理的各组NB4细胞-y蛋白表达程度与NBT复原才能之间呈负相关r=-0.940，P=0.017图6。讨论ATRA对APL的有效治疗是白血病诱导分化治疗的成功典范。但单用ATRA治疗易复发及产生耐药，与其他化疗药物联用时疗效有一

24、定的进步，但毒副反响增加。因此，寻找可以增强ATRA诱导分化作用而毒副反响轻的药物，成为临床治疗中的关注问题之一7，8。最近，Hiran等7根据NBT复原实验结果提出，bestatin可能增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用，但未做进一步的研究。本研究通过对细胞形态、功能和外表分化抗原等多层次的检测及分析比照，说明一定浓度范围的bestatin本身不能诱导NB4细胞分化，但确能增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用。Hiran等7认为，bestatin增强ATRA诱导分化作用可能与其抑制细胞外表D13活性有关。本研究结果显示，与HL-60细胞相似，NB4细胞外表D13阳性表达率高达94.79%，该药是否通过抑制D13表达从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用，尚待进一步研究证实