河北医科大学荧光定量pcr的原理与应用课件

1、荧光定量PCR原理及其应用免疫教研室 杨建岭 荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR标记方法 荧光定量PCR不同方法学的应用 荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR标记方法 荧光定量PCR不同方法学的应用 荧光定量PCR的定量原理Y：扩增产物数量X ：起始模板数量n：扩增循环数Y=X*2n= (1+ Ev) 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR中的三个概念增长曲线 (primary curve)荧光阈值（threshold)CT 值(Cycle Threshold) 阈值：PCR扩增信号进入相对稳定

2、的指数增长期时的荧光信号值 (相当于公式Y= X （1+Ev）n中的Y)Ct值：阈值所对应的扩增循环数n(也就是公式Y= X (1+Ev)n中的n) PCR扩增与实时定量关系图YnCt值阈值Ct值与起始模板的关系Y= X （1+Ev）n LgX =b(常数) n*a (常数), n=Ct Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 常用的荧光标记方法 基于双

3、链DNA 内掺染料的方法EB （第一代）SYBR Green 1 （第二代）LC Green PlusSYTO 9 （第三代）EvaGreen基于序列特异性探针的方法TaqMan探针Molecular BeaconsDual Probes(FRET)第一代常规双链DNA内掺式染料： 溴化乙锭 (EB)首个应用于均一实时检测的方法Russell Higuchi et al. 1992Simultaneous amplification and detection of specificDNA sequences. BioTechnology 10:413417荧光信号随双链DNA的出现而增强信号

4、弱，并且EB对PCR扩增有毒性(抑制作用)已不再使用第二代常规双链DNA内掺式染料： SYBR Green I价格便宜，使用简便更亮 效果优于EB广泛应用可用于熔解分析 + 电泳分析5353SGExcitationSGSGSGSGEmission内掺式染料的工作原理 53535353SGSGSGSGSGEmissionEmissionExcitationExcitation内掺式染料的工作原理 温度荧光强度TmTm值：50%DNA变成单链时的温度。熔解曲线分析PCR过程结束后，将温度缓慢升高，此时双链DNA解链成为单链，内掺染料会被释放出来，荧光信号逐渐减弱将温度对荧光强度的变化求导。(-dI

5、/dT) 峰值代表斜率改变最大时的温度值，即Tm，其值与双链DNA的长度、GC%含量有关，可部分代表序列的特异性溶解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确常用的荧光标记方法 基于双链DNA 内掺染料的方法EB （第一代）SYBR Green 1 （第二代）LC Green PlusSYTO 9 （第三代）EvaGreen基于序列特异性探针的方法TaqMan探针Dual Probes(FRET)Molecular Beacons与目标序列互补TaqMan水解型杂交探针 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FA

6、M、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光RQ53535353ExcitationRQQRQRExcitationTaqMan水解型杂交探针Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递（FRET Probe） 荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR标记方法 荧光定量PCR不同方法学的应用 绝对定量（基因拷贝数的绝对定量） 荧光定量PCR不同方法学的应用 相对定量（ 基因表达调控的相对定量） 相对定量

7、绝对定量 荧光定量PCR不同方法学的应用标准曲线由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线计算待测样品的初始模板浓度 LgX =b Ct*a定量分析绝对定量 未知浓度的样品与标准曲线相比较X1X2Ct1Ct2 相对定量 绝对定量 荧光定量PCR不同方法学的应用定量分析相对定量 Ct 双标准曲线法待测组目的基因平均Ct值待测组看家基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组看家基因平均Ct值F=2-相对定量Ct法：公式： 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一CtCt待测Ct对照F=2 -Ct使用Ct法所要满足的条件：条件： 1.假定目的基因与看家基因的扩增效率一致 2.假定扩增效

8、率为 100 %缺点： 实验条件优化（使目的基因和看家基因扩增效率相同）较为复杂优点： 优化的体系建立后，每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用Ct法得出的分析结果 。（自备标准品，检测样品做3次重复复管）HouseKeeper GeneGene of Interest 定量分析相对定量定量分析相对定量Ct 双标准曲线法相对定量方法二双标准曲线法应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一公式：待测样品目的基因浓度待测样品看家基因浓度对照样品目的基因浓度对

9、照样品看家基因浓度F=优点：消除了由Ev差别而造成的误差，结果更为准确，分析简单， 实验优化简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线相对定量双标准曲线法某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用双标准曲线法得出的分析结果 Comparative Delta-delta Ct法定量先进行预实验，验证目的基因与看家基因的扩增效率是否一致，具体操作如下：先将标准品进行系列稀释作为模板，分别扩增看家基因和目的基因，分别做看家基因和目的基因的标准曲线，比较两个标准曲线的斜率。如果斜率之差小于0.1，说明两者扩增效率相同，可以用比较CT值法进行相对定量完成了上

10、述预试验后，接下来对待测样品和对照样品进行相对定量分析首先分别对待测样品和对照样品的目的基因和看家基因进行扩增，然后将扩增的样品页面进行编辑，将目的基因和看家基因通过“yes”“no”的设定，分别列在两页中，相同的样品命名相同的名称，然后分别分析两页。分析完两页后进入Delta Delta CT 分析界面，进行分析Comparative Delta-delta Ct法定量P1相同的样品在两页里命名成相同的名称，并定义为unknown分别分析P1和P2页选delta-delta Ct选项依次填入，并定义对照样品完成分析P2公式 特点及注意事项优点：当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家

11、基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。缺点：每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。注意事项：在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量

12、方法。将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。 预试验分别对待测样品和对照样品的看家基因和目的基因进行扩增 。 将目的基因和看家基因分别编辑在两页中（page），并将同一样品命名成相同名称。 Page 2：目的基因，其中10-18号管通过YES选中，样品分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可以不进行编辑。Page 1：看家基因，其中1-9号管通过YES选中，样品分别命名为A、B、C，其它未选中的样品可以不进行编辑。通过进入Analysis，分别对page1和page2进行分析。注意：由于没有标准品，软

13、件无法自动给出阈值，需用手动设定，软件会提示需手动进行阈值设定，此时只要点中右侧按扭，在荧光曲线图中上下拖动光标即可。 问题：在分别分析两页时，是用绝对定量分析方法进行分析还是用别的方法分析？Validation Run Performed，提示是否已验证过两个基因的扩增效率一致，可用该定量方法进行分析。Gene of Interest Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了目的基因的那一页；Normaliser Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了看家基因的那一页；Calibrator Defined，选中A、B、C三个样品中用来作为对照

14、组的一个。 双标准曲线法定量稳定的梯度稀释标准品：梯度稀释的含目的基因的质粒或PCR产物，并设类型为Standard，给出浓度待检测样品：扩增目的基因unknown同一待测样品命名同一名称，并设类型为unknown分别分析P1和P2页选Two Standard Curve选项依次填入，并定义对照样品完成分析稳定的标准品：梯度稀释的含看家基因的质粒或PCR产物，并设类型为Standard，给出浓度待检测样品：扩增看家基因unknownP1P2公式 特点及注意事项优点：应用简便，无需像Delta-delta CT法那样对实验进行严格的优化。缺点：每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。 注意事项：如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。1-6为目的基因的标准曲线，7-12为看家基因的标准曲线，待测样品A、B、C，其中15-17扩增了样品的看家基因，18-20扩增了样品的目的基因。将所有目的基因编辑在一个page里，所有看家基因编辑在另一个page里，且相同的样品以同样名称命名。编辑完成之后即得：Page 1：看家基因，其中7-12号管为标准曲线，通过YES选中，15-17号管为待测