细胞生物学研究方法之细胞组分研究课件

1、第二节 细胞组分的分析方法离心分离技术细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法特异蛋白抗原的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性放射自显影技术 定量细胞化学分析技术第二节 细胞组分的分析方法 一. 细胞组分的分离方法差速离心和密度梯度离心离心技术用途： 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体等细胞器，以及各种大分子基本手段。一般认为，转速为10000-25000r/min的离心机称为高速离心机；转速超过25000r/min，离心力大于89K者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达80000r/min，离心力超过500Kg。是分离细胞器及各种大分子基本手段。（一）差速离心

2、Differential centrifugation沉降系数（sedimentation coefficient ）： 根据1924年Svedberg（离心法创始人-瑞典蛋白质化学家）：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度：s=v/2r。 s是沉降系数，是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。 沉降系数以每单位重力的沉降时间表示：120010-13秒，10-13这个因子叫做沉降单位S，即1S=10-13秒， 差速离心是指低速与高速离心交替进行，使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来，达到分离的目的。沉降系数差别在一个或几个数

3、量级的颗粒，可以用此法分离。沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开。如血红蛋白的沉降系数约为4S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。样品离心时，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质

4、网与高基体核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 Low speedHigh speedDifferential centrifugation离心图像中表现几个峰，说明样品中有几个组分，每一个峰代表相应组分的沉降界面，因此可以测定每一个组分的沉降系数值。根据峰的面积可以测量组分的浓度值 一个对称的峰形，一般可以认为样品是离心均一的 （二）密度梯度离心速率区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法； 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升

5、高的密度梯度；介质（蔗糖、多聚蔗糖、氯化铯、甘油）介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带；(1) 密度梯度配制好后, 应十分小心放置, 任何摇动或 温度骤变都可能破坏梯度的结构; (2) 应把握好加入样品的体积, 不能超过梯度的分辨能力。直径是2. 5cm 的离心管, 可加1. 03. 0ml 的样品。 一般而言, 在较长的梯度柱上铺较薄的样品带, 能获得较高的分

6、辨率, 具体的加样量, 还要根据梯度的斜率、样品在离心过程中的丢失量及经验来判断; (3) 加样也是决定梯度离心效果的重要因素, 要尽量轻 巧, 避免样品与梯度混合。2.等密度沉降 isopycnic sedimentation用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度高，斜率大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。力场比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentationDNA

7、特异性的显示方法多糖的显示方法脂类物质的显示细胞中各种酶的显示蛋白质显色方法DNA特异性的显示方法Feulgen反应： 利用酸水解去除细胞中的RNA，仅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脱氧核糖核酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基与希夫试剂反应呈紫红色。多糖的显示方法PAS（过碘酸希夫氏）反应 利用过碘酸的强氧化作用破坏糖分子的CC键，使糖分子氧化产生双醛基，自由的醛基与希夫试剂作用形成紫红色产物。脂类物质的显示方法 对脂类物质的染色应用的是物理的扩散原理。苏丹类染料是脂溶性染剂，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，它会脱离酒精而溶于脂类结构中从而显色（

8、深红）。四氧化锇:与不饱和脂肪酸反应成黑色， 脂肪滴细胞中各种酶的显示方法 由于酶易受外界条件影响而变性失活。因此对酶的显示一般采取间接的方法进行，对可以与酶发生特异性结合的底物进行染色从而达到显示酶的目的。因此在实验的过程中需在尽量保持酶的活性。细胞核红色，酸性磷酸酶活性部位呈棕黄至棕黑色 蛋白质显色方法（1）茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质水解后产生的氨基酸可发生茚三酮反应。除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 氨基酸与茚三酮在弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成

9、紫红色，最终为蓝色物质。脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。该反应可广泛用于各种氨基酸的定性或定量测定。三、特异蛋白抗原的定位与定性： 免疫学是研究机体免疫系统组成、结构和功能的一门独立的前沿学科。 细胞内蛋白质定位法：免疫荧光技术和免疫电镜技术 蛋白质体外定性法：免疫印迹、放射免疫沉淀、蛋白质芯片和质谱分析基于免疫学中抗原抗体特异性反应的原理而设计的。将抗体分子上加上不同的可供识别的标记，从而显示出某种蛋白质在细胞内的分布和定位。抗原抗原抗体特异性结合免疫荧光标记免疫酶标记常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（明亮的黄绿色荧光 ）、罗丹明（呈橘红色荧光 ）等。快速、灵敏、有特异性，但其分辨率

10、有限酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。提高分辨率 铁蛋白免疫电镜技术： 以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。免疫酶标技术免疫胶体金技术是以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。胶体金颗粒带电情况 抗体和金颗粒的耦联（图出处：IV

11、D Technology） 细胞外蛋白质的分析蛋白电泳(SDS) 免疫印迹反应(Western-Blot)蛋白质芯片质谱分析四、细胞内特异核酸的定位与定性 用核酸探针（放射性元素、荧光素标记）确立特殊核苷酸序列在染色体上或在特殊类型细胞中的位置的方法称为原位杂交技术(in situ hybridization)。 把凝胶电泳分离开的DNA片段，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，做成一个凝胶的复制品，这个过程叫做印迹。将硝酸纤维素膜与带有放射性标记的探针杂交，通过放射自显影就可以辨认出与探针互补的特殊的核苷酸序列。 利用标记的DNA探针检测某一特定的DNA序列的方法称为Southern blo

12、t，检测特定RNA序列的方法称为Northern blot。人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 基因组原位杂交大小麦杂交后代中大麦遗传物质的鉴定以特异序列为探针鉴定rDNA在染色体上的分布 五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光，对细胞内生物大分子进行定性、定位和半定量研究的一种细胞化学技术。利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-

13、UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。14C半衰期为5730年，3H为12.5年。六、定量细胞化学分析技术： 显微分光光度测定技术和流式细胞仪流式细胞仪原理：待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后进入充满鞘液的流动室，鞘液压力与样品流压力是不同的，当二者的压力差异达到一定程度时，鞘液裹挟着样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。将细胞中感兴趣的部分特异性的标上荧光染料，那麽这些染料将在细胞通过激光检测区时受激光发出特定波长的荧光,通过一定波长选择通透性的滤色片,我们可将不同波长的散射光、荧光信号区分开来，并送到不同的光电倍增管中，经过一系列的信号转换、放大

14、，数字化处理，我们就可以在计算机直观的统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。 正负不同的电荷，液滴流经带有几千伏特的偏转板在高压电场的作用下偏转，收集容器中从而实现细胞的分离。1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。G1、G2、S三期 右侧数字含义：M

15、ean G1=195.4即G1期DNA含量平均值为195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%； 显微分光光度测定技术 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞的培养动物细胞培养原代培养细胞（primary culture cell） 传代培养细胞（sub-culture cell）细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制细胞系（cell line） 亚二倍体，接触抑制丧失组织培养的意义植物细胞 类型： 原生质体培养

16、 （体细胞培养） 单倍体细胞培养（花药培养） Hela细胞（左）、CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞 右）的培养细胞培养： 将动、植物细胞或组织从机体内取出分散成单细胞悬液，给予必要的生长条件，让其在培养基上继续生长繁殖的过程。动物细胞培养的基本过程：取材 分离细胞 选择相同类型的细胞 贴壁培养 传代（一）动物细胞培养原代培养（primary culture cell）:培养来自动物机体的细胞群。传代培养（subculture cell）:原代培养的细胞在生长一定时间以后，就会由于营养成分的消耗、代谢产物的积累以及接触抑制等因素而停止生长，因此必需将细胞传到新的培养瓶中去使其继续生长。细胞系（cel

17、l line）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，但有极少数细胞可能渡过危机而传下去，这些细胞一般又可顺利传代40-50代，并且保持染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。这种传代细胞称为细胞株。细胞系：由细胞株传至50代后又出现危机不能再传下去，但是如果有部分细胞发生了遗传突变就有可能在体外培养的条件下无限制地传下去。这些细胞具有癌细胞的特点，这种传代细胞称为细胞系。细胞系的特点是染色体发生明显变化，失去接触抑制的特性。实验室中常用的几种细胞系细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞Henrietta

18、 Lacks BHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP20骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 细胞培养的意义可以在离体条件下观察研究细胞生命活动的规律；观察细胞对于各种生物活性物质的反应；通过细胞培养可以获得大量性状相同的细胞，是一种良好的实验材料。（二）植物细胞培养外植体培养：诱发产生愈伤组织。用于研究植物的生长发育、分化和变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。悬浮细胞培养：适合于进

19、行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。Plant Cell CultureAnimal Cell Culture (三)、非细胞体系 来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系（cell-free system）。 用途：研究DNA复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制以及细胞核装配等。 二、细胞

20、工程 细胞工程是一种在细胞水平上运用细胞生物学和分子生物学的方法改变生物遗传性状的生物工程。细胞融合(fusion)与细胞杂交(hybridization)技术单克隆抗体（monoclone antibody）技术 细胞拆合与显微操作技术其它技术 遗传分析（mutant, knock out, knock in） （一）细胞融合与细胞杂交技术 通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。同核体：相同基因型的细胞融合而成。异核体：不同基因型的细胞融合而成。自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。诱发融合：异种间的细胞必须经诱

21、导剂处理才能融合。 诱导细胞融合的方法：动物细胞融合： 生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒 ）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。植物细胞融合：先用纤维素酶去掉显微素壁（二）单克隆抗体技术克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。单克隆抗体技术B淋巴细胞能分泌特异抗体，但不能长期培养，瘤细胞可以在体外长期培养，但不分泌特异抗体。于是Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。将免疫淋巴与骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。这种细胞既能够像肿瘤细胞那样长期进行无性繁殖，又能像淋巴细胞那样分泌抗体。而且由于这种抗体可以是由单一的无性繁殖细胞系的细胞产生的，故又可以称单克隆抗体。 单克隆抗体制备过程 注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够