放射免疫-荧光标记免疫课件

1、 现代免疫分析技术-放射免疫与荧光免疫免疫分析技术的发展多元免疫技术免疫沉淀免疫凝集补体结合反应中和反应免疫标记技术经典免疫学方法化学发光胶体金酶免疫免疫荧光放射免疫PCR-免疫分析时间分辨荧光分析免疫标记技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏度特异性免疫标记技术的主要特点：高特异性、高灵敏度免疫技术+标记技术检测方法 检测范围生化、常规免疫 mgg（10-3 10-6 g）荧光免疫、酶免疫 gng（10-6 10-9 g）放射免疫、发光免疫 ngpg（10-9 10-12 g）PCR pgfg（10-12 10-15 g）标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。免疫技术：以抗原-抗体

2、反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记免疫分析：是利用多种标记技术与免疫技术相结合而建立的测定技术体系。其核心即是高灵敏性和高度特异性的有机结合。标记免疫技术基本概念放射免疫技术1959年，美国，Yalow和Berson测定血清胰岛素含量（标记抗原）1977年获诺贝尔医学奖 放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA） 优点：特异性强，灵敏度高，结果准确，检样用量少，结果重复性好，操作易自动化；缺点：对抗体质量要求高，有放射性危害，检测仪器价格较高 Ag Ab *Ag Ag-Ab+标记抗原（F） 特异性抗体 被检抗原 非标记抗原抗体复合物标记抗原抗体复合物（B）

3、*Ag-Ablimited, competitive 1.1 放射免疫分析（RIA）技术原理抗原标准品与待测抗原 结构-完全相同/结构相似且亲和力相近 纯度-纯度90%以上（免疫纯） 较高的放射比放射性同位素特异性抗体 特异性高、亲和力高（Ka）、效价高 。“三高”！ 1.2 放射免疫技术基本条件标记核素125I 3H 射线 理化性活泼 差核素丰度 90% 半衰期 60.2d 12.3y标记方法 简单复杂标记设备 低廉( 计数仪)昂贵( 液闪仪)测量条件 简单 复杂125I -标记物的鉴定比放射性：单位化学量标记物中所含的放射性强度;免疫活性：与过量抗体反应的百分比越大，标记物免疫活性越好 游

4、离抗原与免疫复合物的分离第二抗体沉淀法 PEG 沉淀法 PR 试剂法 活性炭吸附法 分离彻底，迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响 操作应简单、重复性好经济 Ag* Ab Ag 标记抗原 特异性抗体 待测抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗体复合物分离Ag*-Ab 和游离Ag*从标准曲线上读知含量 测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性 放射免疫测定法(RIA)示意图 1.3 放射免疫技术基本类型液相法 平衡法（一步法） 顺序加样法 固相法免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA）1968年，Miles 和Hales应用同位素标记胰岛素

5、抗体，成功检测牛血清中的胰岛素。Type IRMARIA被标记物质抗体抗原抗体用量过量限量被检抗原相对分子量相对较大相对较小反应方式分步结合竞争结合B、F分离方法固相洗涤分离液相沉淀/吸附分离2.1 免疫放射技术基本条件标记抗体的制备 抗体亲和力要求不高固相抗原免疫吸附剂 对抗原吸附力强，对非特异性蛋白吸附少，结合过程中高度分散 （重氮化纤维素，琼脂糖4B珠）2.2 免疫放射技术基本类型 经典IRMA） 双抗夹心法2.2 免疫放射技术基本类型荧光免疫技术Immunofluorescence technique， IFAIntroduction:1958年，Riggs等合成了异硫氰酸荧光黄（fl

6、uorescent isothiocyanate，FITC）；Marshall对荧光标记方法进行了改进，荧光技术逐渐推广1942年，Coons等，异硫氰酸荧光素标记抗体，检测小鼠组织切片中可溶性肺炎链球菌多糖抗原IFA荧光素敏感可测抗原抗体反应特异性显微技术高度精确优点：特异性强，敏感性高，速度快，结果直观-病原微生物缺点：荧光标本保存难（淬灭）非特异性染色 荧光免疫分析（IFA）技术原理YYY 一种有机或无机化学物质，其接受激发光后，能够以发射光形式产生明亮的荧光而作为染料使用。 各种荧光素都有各自的激发波长和发射波长。因发 射波长不同而颜色不同。 异硫氰酸荧光黄（FITC），四乙基罗丹明（

7、Rb200），藻红蛋白（PE）。 荧光免疫分析（IFA）基本条件 1. 荧光素较高较稳定的荧光效率具有能与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团与蛋白质结合简单快速结合产物的荧光颜色与实验对象的自发荧光对比鲜明结合物具有一定的耐贮藏性 标记用荧光素应具备的条件抗体：特异性强、效价高、标记后活性高标记前：梅花状双扩测效价标记抗体种类：多克隆抗体、单克隆抗体、葡萄球菌A蛋白（荧光二抗通用试剂） 2. 待标记抗体1mg/mL FITC（ 异硫氰酸荧光黄）标记抗体Marsshall法原理 当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖

8、氨酸残基，一般最多能结合1520个。 3. 荧光标记抗体制备与纯化荧光素- FITC- NC N - 蛋白质 FITC- N C N - 蛋白质 S H H H S H 操作流程抗体的准备：20mg/ml(抗体+生理盐水+碳酸盐缓冲液） 碳酸盐缓冲液为总量的1/10。荧光素的准备：根据欲标记的蛋白总量，每毫克加入0.01mgFITC （抗体与荧光素比例为50-100:1）标记：边搅拌边将称取的荧光素加入抗体溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或搅拌棒上，继续搅拌12-18h，4透析：离心去沉淀，装入透析袋pH8.0缓冲盐水透析过夜，0-4过柱：葡萄糖凝胶G50或 G25柱分离游离荧光素保存

9、：4 -40等量甘油分装保存。 3. 荧光标记抗体制备与纯化 4. 荧光标记抗体鉴定1 特异性染色效价测定-与相应抗原标本染色2 非特异性染色测定-与相类似抗原标本染色3 吸收试验-在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原阳性 标本染色，结果无明显阳性荧光。4 F/P比值的测定方法F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量， F/P=1-2， 过高-非特异染色增强； 过低-荧光很弱，降低敏感性。 经典荧光抗体染色法流式细胞仪（Flow Cytometor, FCM），以荧光免疫技术为基础发展起来的专门的细胞分析技术。是一项集液流喷射技术、激光技术、电子物理技术、光

10、电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的检测仪器。 现代免疫荧光技术 1. 流式细胞技术1. 流动室及液流驱动系统2. 激光光源及光束形成系统3. 光学系统4. 信号检测与存贮、显示、分析系统5. 细胞分选系统 流式细胞仪工作原理荧光染色的细胞（微粒）悬液标本High Pressure流动室及液流驱动系统若干组透镜、滤光片、小孔 -将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器 单细胞分析：任何单细胞悬液，如血液、骨髓、体液中的细胞、培养细胞，实体组织经处理后制成单细胞悬液。快速分析：极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪可以每秒钟数十、数百、数千

11、个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。 流式细胞技术应用多参数分析：可同时分析单个细胞的多种特征,当同时用多种分子探针,如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色,通过流式细胞分析,即可获得单细胞的多种信息,使细胞亚群的识别、计数等更为准确。定性或定量分析：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度等均可进行单细胞水平的定性与定量分析。 流式细胞技术应用1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini和Hemmila首次建立稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫技术分析”理论；1984年，Hemmila确定了DELFIA免疫荧光技

12、术方案，从而使DELFIA成为Wallac的专利技术。1989年该技术获诺贝尔化学奖提名。90年代以来，时间分辨荧光技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。目前，时间分辨免疫荧光技术正成为现代医学研究中最有发展的研究手段之一。 2. 时间分辨免疫荧光技术 Time-resolveduoroimmunoassa（TrFIA）示踪剂：三价稀土离子包括有铕（Eu），钐（Sm），镝（Dy）等。双功能基团螯合剂：示踪剂通过具有双功能基团螯合剂与抗体（或抗原）以共轭双键结合成标记物。稀土离子螯合物荧光光谱特点：1）特异性强

13、；2）Stokes位移大；3）荧光寿命长解离-增强技术：螯合剂在中性条件下与镧系离子形成稳定的螯合物，而在增强液（酸性）作用下，镧系离子迅速被彻底释放并与增强液中的配体螯合，使其荧光得以成千万倍地放大。TrFIA的原理通过延续时间，使特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使理论本底达到0。发射光谱与激发光谱之间存在很大的Stokes 位移。通过干涉滤光片可将发射光谱与激发光谱完全分离。技术特点检验先进性时间分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发荧光分离零背景、特异性高灵敏度高解离-增强荧光性大大提高稳定的荧光螯合物线性范围宽高灵敏度原子标记标记位点多，可达20个，对标记物结构及活性影响