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文档简介

1、细胞免疫荧光技术实验目的掌握免疫荧光技术的基本原理熟悉细胞免疫荧光技术的方法了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果实验原理原位检测抗原抗体特异反应间接法 间接荧光抗体染色法示意图抗原抗体荧光素标记的抗抗体激发光显示荧光Hela细胞Vinculin实验用品试剂：固定液：4%PFA细胞通透：0.2%TritonX封闭试剂：10%正常山羊血清一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体二抗:Alexa Fluor555标记的山羊抗小鼠IgGDAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）PBS洗涤缓冲液：PH7.4材料：Hela细胞细胞培养皿仪器：荧光显微镜实验步骤 一，细胞制备和细胞固定将细胞铺在24孔

2、板中将细胞培养至所需密度加入4%PFA固定10min染色或保存PBS洗涤PBS洗涤实验结果三，观察human HeLa cells 实验中应注意的问题 细胞不要铺的过密:60-70% 防止细胞污染 固定时间不要太长,一般10-30min TrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理 选择合适的封闭液 二抗孵育后,一定要洗干净 必要时用恒温摇床摇洗免疫细胞化学技术注意事项 选择合适的方法 材料要留好 选择抗体 选择标记酶 封闭液的选择 设定对照实验思考题检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法，用什么仪器观察？A疑难解答一，缺乏染色 可能的原因 无抗原 抗体失效 固定不充分 过度固

3、定 抗原修复无效 不兼容的二抗和一抗 漏用试剂或未按正确的顺序 加入试剂相应的措施 用原位杂交方法检测蛋白表达 按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融 增加固定时间或改用不同的固定剂 减少固定时间;抗原修复 增加修复时间或更换修复液 使用可以与一抗结合的二抗 重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序 可能的原因 一抗或二抗的浓度过高 一抗和/或二抗与组织的 非特异性结合 组织过于干燥 试剂粘附在旧的 或未制备好的玻片上相应的措施预实验摸索最佳浓度一抗孵育前封闭 (最好是二抗来源的血清)在染色过程中避免组织干燥用新鲜制备或购买的玻片进行实验三，细胞/组织的形态被破坏四，染色不正确 可能的原因 固定方法对于抗原不合适 抗原修复方法不合适 没有及时固定引起抗原的扩散 相应的措施 尝试不同的固

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