大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件

1、植物脱毒技术植物脱毒技术一 植物病毒及植物物脱毒技术 1 植物病毒 2 植物病毒的危害 3 植物脱毒技术概念 4 植物脱毒技术的一般方法二 茎尖脱毒技术的方法步骤 1 原理 2 基本步骤 3 影响茎尖脱毒效果的因素三 其它脱毒技术方法介绍四 脱毒技术的应用 一 植物病毒及植物物脱毒技术一 植物病毒及植物物脱毒技术 1 植物病毒： A 病毒（virus）是一类非细胞结构的专性寄生的，极微 小的分子生物，有核酸和蛋白质组成，以复制繁殖。 B 主要存在于植物细胞内的病毒（类病毒）称为植物病毒（非系统分类）。 C 植物病毒形态 在生物界中，植物病毒形态最小，观察病毒需放大数万倍的电子显微镜，度量病毒大

2、小的尺度为纳米，其形态有球状、杆状、线条状，少数弹状。 一 植物病毒及植物物脱毒技术大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件D 植物病毒结构 植物病毒结构简单，杆状、线条状的病毒，粒体中间是螺旋状的核酸链，外面是蛋白质亚基组成的衣壳。D 植物病毒结构 植物病毒结构简单，杆状、线条状的病毒，大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件E 植物病毒的发展简史 1症状描述期2病原研究期 代表人物：Adolf mayer（1882），Dmitrii Ivanowski（1892），Martinus Beijernek（1898）。3病理学研究期 研究植物病毒的

3、传播介体。4生物化学、生物物理学研究期Stanley（1935）从TMV汁液中提取出一种蛋白质的晶体。Bawden和Pirie（9136）证实TMV汁液中除蛋白质外，还有核酸，两者比例为核酸5%、蛋白质95%。E 植物病毒的发展简史 1症状描述期 2 植物病毒的危害：A 种类多，范围广，已发现植物病毒有700种。大多数农作物特别是利用无性繁殖生产的农作物都受到一种或一种以上病毒感染而且带毒株率高。Ex.苹果60%-100% B 危害程度仅次于真菌病害 C 不易防治，潜隐性危害更大 D 植物病毒的症状类型 症状是认识病毒的第一步，具有诊断价值，其症状类型有花叶、坏死、畸形。 2 植物病毒的危害：

4、大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件E 复合侵染和复合症 1干扰作用 指两种有亲缘关系的病毒侵染同一种植物，其表现的症状比单一侵染所表现的症状要轻。其中主要是交互保护，指先侵入的病毒可以保护植物不受另一个病毒的侵染，一般是弱株系诱发对强株系的抗性。2协生作用 两种无亲缘关系的病毒混合侵染后所表现的症状比它们单独侵染所表现的症状更为严重。F 植物病毒症状隐潜 潜伏侵染 病毒侵染植物后不表现症状或难以觉察的症状，但病毒可以在体内增殖称潜伏侵染。带毒体 受病毒侵然而不表现症状的植物。I 感病寄主内部病理变化 （一）筛管、筛板堵塞（二）组织坏死产生坏死斑

5、（三）病细胞结构发生变化（四）内含体的产生内含体是寄主细胞内的病毒核酸和寄主细胞内的蛋白质、甘糖等物质聚集在一起形成的一种混合体。其种类有X-体和晶状体。 E 复合侵染和复合症 1干扰作用 指两种有亲缘关系的病毒 3 植物脱毒技术概念： A 广义：消除包括病毒、真菌、细菌在内的微生物病原体 B 狭义：单指消除植物细胞、组织内的病毒、类病毒 （本节重点为狭义脱毒所涉及内容） 4 植物脱毒技术的一般方法： A 从材料角度分： 茎尖培养脱毒（或顶端分生组织）、珠心胚培养脱毒、微尖嫁接脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织培养脱毒大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件 B 从处理手段角度分： 高温处理 物理

6、方法脱毒 低温处理 化学方法脱毒 病毒唑（1,2,4-三唑-3-酰胺-1-BD-呋喃糖） 抗病毒血清处理 生物方法脱毒 RNA 合成抑制物（防线菌素D） 大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件高温处理： （该方法可能会遇到的问题是什么？如何解决？） 原理：基本原理是在高于正常的温度下，植物组织中的病毒 可部分或全部失活（钝化），但是很少或甚至不伤害寄主植物组 织细胞。 A B C 低 热处理区 高 温 温 生长区 无损伤 病毒热死点 植物热死点 应用热处理脱毒也有一定的局限性，主要缺点在于并非所有病毒都对热处理敏感。热处理只对那些球状的病毒(如葡萄扇叶病毒、苹果花叶病毒)或线状的病毒(如马

7、铃薯X、Y病毒及康乃馨病毒)有效果，而对杆状病毒(如牛蒡斑驳病毒、千日红病毒)不起作用。应用热处理脱毒也有一定的局限性，主要缺点在于并非所有病毒都对二 茎尖脱毒技术的原理和方法 1 基本原理（采用茎尖的原理） 利用病毒在植物体内的分布不均匀性，一般情况下，病毒在植物的顶端分生组织中不存在或只有较低的浓度（胚中也是这种情况，为什么？） 2病毒分配不均匀性的可能原因： A 物理隔离：分生组织微管系统或胞间连丝不发达，细胞分 裂速度快于病毒侵染速度 B能量竞争 ：病毒核酸和植物细胞分裂时都须要消耗大量的 能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是 自我提供能量自我复制，这样病毒核酸复制就得不 到

8、足够的能量。 C 存在病毒钝化系统：植物不同部位细胞的防卫系统能力的 差别。 D 抑制因子存在二 茎尖脱毒技术的原理和方法2病毒分配不均匀性的可能原因： 2 基本步骤 （1）母体的选择 （2）母体（预）处理 （3）茎尖的分离 （4）茎尖的培养和小批量快繁 （5）效果检验 （6）大批量快繁及无毒原种保存。大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件 2 基本步骤 （1）母体的选择 欲脱毒材料的品种典型性 植体健康程度选择 大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件（2）母体（预）处理 A 可采用物理、化学、生物方法（如前述） B 但是一般是热处理（母体较大、热处理好操作） C 热处理的参数选择：

9、a 加热方式：热水或热空气 b 温度选择：视情况而定，直线式或交替式 c 湿度的保持：必须 d 和其它方式联合实行 （2）母体（预）处理 热处理举例：香石竹（康乃馨）在38-40度经过两个月处理可除去全部病毒菊花在35-38度的条件下处理60天可使病毒失活马铃薯在37度条件下处理10-20天能除去卷叶病毒柑橘速衰病毒/黄化病毒在40/30度条件下处理7-12周 鳞皮病毒需要40/30度条件下处理8周 碎叶病毒需要50度条件下处理3-22小时 大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件（3）茎尖的分离 A两种情况： 无菌状态剥离外层根尖 有菌状态剥离茎尖常规消毒 B 注意根尖大小： 茎尖过大脱毒

10、效果不彻底 茎尖太小培养再生困难 （3）茎尖的分离大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件二 茎尖脱毒技术的原理和方法 2 基本步骤 （4）茎尖的培养和小批量快繁： 丛生芽（不定芽诱导） 单芽切割 诱导生根（换培养基） 练苗 移栽 二 茎尖脱毒技术的原理和方法（5）脱毒效果的检测： A 直接检测法：直接观察待测植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的特定病状，从而可以判断病毒是否存在。例如矮缩病毒引起寄主植物叶片褪绿、坏死、扭曲、植株矮缩等。 但是对于多年生木本植物本法存在在着效率不高的缺陷。 （5）脱毒效果的检测：B 指示植物法：将一些对某种病毒反应敏感、症状特征显著的植物作为指示植

11、物，用以检验待测植物体内特定病毒的存在。该法具有灵敏、准确、可靠、操作简单，在传统的检验方法中有着不可代替的作用。（包括a汁液涂抹法和b嫁接法） a汁液涂抹法：待测脱毒植物幼叶1-3克 + 0.1M磷酸缓冲液 指示植物 磨成匀浆 叶片上涂一层金刚砂 脱脂棉蘸取少量匀浆 创伤叶片 适宜条件培养 观察目标形状 大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件： C 电镜观察常用的负染技术是指染料的重金属离子在样品四周堆积，增强样品四周的电子密度，造成很强的电子散射能力，形成了一个很暗的背景，而样品对这种染料无亲和作用，所以没有重金属离子堆积，很容易为电子束穿过，形成一个明亮的电子透明区，衬托出样品的形态

12、和大小。 ：大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件 D 血清 学技术是植物病毒诊断鉴定和分类工作的最重要手段之一，也是进行植物病毒研究的重要方法及确定病毒种类、株系，测定病毒之间亲缘关系的重要工具。1抗血清的制备利用植物病毒衣壳蛋白的抗原（antigen）特性，可以制备病毒特异性的抗血清（antiserum）。抗原是指能刺激动物机体产生抗体，并能与所产生的抗体进行专化性结合的物质。抗体（anti-body）指生物机体由于受外来抗原的刺激而产生的物体，存在于动物的血清中，是一种免疫球蛋白。 大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件2血清学反应 是抗原和抗体专化性的结合，最常用的有两种方法。

13、（1）琼脂单向扩散法 在一定浓度的琼脂凝胶中，抗体与抗原互相扩散，在适当的位置形成沉淀线，沉淀线的形状说明抗原与抗体的相互关系。 2血清学反应 是抗原和抗体专化性的结合，最常用的有两种方法（2）酶联免疫吸附（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）法，该方法利用酶的放大作用，使免疫监测的灵敏度大大提高。优点：灵敏度高；速度快；专化性强，重复性好；检测对象广；处理样品多。此法是实现“快速、准确、经济”检测的最好手段之一。（1） 将抗原吸附在酶联板表面，保湿吸附后冲洗；（2） 加抗原、冲洗，形成抗体+抗原复合物。（3） 加入酶标抗体、冲洗，形成抗体+抗体-

14、酶的复合物。（4） 加入酶的底物。（5）酶联板静放1小时，底物进行水解，根据溶液的颜色变化判断反应结果 （2）酶联免疫吸附（enzyme linked immunoE 核酸杂交技术核酸的分子杂交主要在DNA和RNA之间进行，依据是RNA与互补的DNA之间存在着对应的碱基互补关系，当双链DNA之间的H键在加热等变性条件下被破坏时，两条链解开成单链，此时加入互补的RNA，在一定的温度和离子强度条件下会形成稳定的RNA-DNA异质双链。形成异质双链的过程称杂交，由于杂交在分子水平上进行，所以称分子杂交，这种异质的双链分子称杂交分子。 （关键是特异探针制备）（6）大批量快繁及无毒原种保存 （ 无性系的

15、保存参考15章） E 核酸杂交技术核酸的分子杂交主要在DNA和RNA之间进行 3 影响茎尖脱毒效果的因素 * 母体材料病毒侵染的程度 * 外植体的生理状态 * 起始培养茎尖的大小大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件 三 其它植物脱毒技术 1 珠心胚培养脱毒 例子：柑橘类多胚品种中除了一个受精胚以外，尚有多个由珠心细胞形成的无性胚，称为珠心胚。珠心胚与维管束系统无联系，因此由珠心胚产生的植株全部均无病毒。但珠心胚 大多是不育的，必须分离培养才能发育成正常的幼苗。珠心胚培养技术对除去柑橘主要病毒，如引起银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、柑橘速衰病等的病毒，都十分有效。珠心胚由珠心组织细胞即体细

16、胞发育而成，具有和母体相同的遗传特性。 三 其它植物脱毒技术2 微尖嫁接脱毒（Micrografting shoot-tip, MGST)木本植物茎尖培养难以生根形成植株。为了克服这个困难、可将实生苗砧木培育在培养基上，再从成年无病毒树枝上切取茎尖（0.141.0mm），在砧木切断面上进行试管微体嫁接，就可获得无病毒的幼苗。利用这个方法，柑橘类嫁接成活率为30%50%，移栽成活率约95%，嫁接两年后即可结实。应用这个技术，可获得柑橘类没有银屑病植株、桃树没有洋李环斑病毒、洋李矮缩病毒、褪绿叶斑病毒的无病毒苗。 大学课程植物组织培养13植物脱毒-组培课件3 愈伤组织培养脱毒 在带毒植物脱分化形成

17、的愈伤组织中，并不是所有的细胞都 均匀带毒，利用此种现象，可以把脱分化的愈伤组织细胞再 分化形成植株的过程中，结合化学、生物除毒手段实现植物脱 毒。*脱分化细胞不带毒原因？4 花药培养脱毒 主要在草莓中实现 1 病毒的复制、侵染速度赶不上细胞分裂速度2 细胞获得了抗性还有其他方法吗？3 愈伤组织培养脱毒4 花药培养脱毒1 病毒的复制、侵染速度5超低温处理超低温脱除植物病毒法是基于超低温保存(Cryopreservation)结合组织培养和病毒检测技术达到脱毒的目的。超低温保存是种质资源长期保存的一种理想方法。因为在液氮中(196)不仅可以长期保存植物材料，而且可以保证材料的遗传稳定性，并且要求

18、的存贮空间最小，维护费用低在超低温处理过程中，导致细胞死亡主要发生在冰冻和冻融期间，在此期间，细胞的结构和功能受到严重损伤，致死冻融的细胞难以恢复生长而死亡。含有病毒的顶端细胞液泡较大，胞液中含有的水分也较多，在超低温保存过程中易被形成的冰晶破坏致死，而增殖速度较快的分生组织含的水分少，胞质浓，抗冻性强，不宜被冻死。这样超低温处理过的植株再生后可能是无病毒的，因此，超低温保存作为一种可能去除病毒的方法而受到人们关注。Brison等首次报道采用茎尖超低温保存方法成功去除了李树PPV病毒，脱除率达到50%，而茎尖脱毒只有20%。Helliot等研究表明，香蕉茎尖通过超低温保存，2%材料脱除香蕉(C

19、MV)，87%材料无香蕉条纹病毒(BSV)感染，而常规分生组织方法不能脱除CMV病毒，对BSV的脱除率只为76%。Wang等用玻璃化超低温法去除了葡萄病毒A(GVA)，成功率高达97%，而单独的分生组织培养脱毒率仅为12%。蔡斌华等首次利用玻璃化超低温法成功地去除了草莓轻型黄边病毒（SMYEV)，脱毒率达到95%。5超低温处理白建明等尝试用超低温保存法和常规方法(茎尖分生组织培养、温热疗法以及温热疗法结合茎尖分生组织培养)来去除马铃薯试管苗中的马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)和PVX。结果显示，马铃薯茎尖经过超低温保存后，存活率和成苗率分别为8364%和7204%，高于茎尖分生组织培养(4667%和3149%)、温热疗法(7222%和4444%)以及温热疗法结合茎尖分生组织培养(5054%和3038%)。4种方法都可以去除PVX，其中超低温保存法的脱毒率最高，为5913%，温热疗法结合茎尖分生组织培养为5602%，温热疗法和茎尖分生组织培养较低，为4261%和3583%。曾继吾等采用玻璃化法超低温保存技术保存带有香蕉束顶病毒（BBTV)的香蕉茎尖，再生后植株BBTV脱除率达到606%，而常规的茎尖培养对BBTV的脱除率仅为267%。白建明等尝试用超低温保存法和常规方法(茎尖分生组织培养、温热采