EPA对慢性应激诱导的外周巨噬细胞功能及细胞膜不饱和脂肪酸组成变化的影响

1、EPA对慢性应激诱导的外周巨噬细胞功能及细胞膜不饱和脂肪酸组成变化的影响李玉玉;张才;薛红莎;刘白平;张永平;宋采【摘要】 Major depression is usually accompanied by inflammation response,increased stress hormones and the change of cellular membrane polyunsaturated fatty acids(PUFAs)composition. PUFAs are important components of the neurons and immune cellula

2、r membranes. Eicosapentaenoic acid(EPA)is a natural anti-inflammatory active substance that can improve depression. To investigate the effect of EPA on depression-like behaviors,peripheral immune and fatty acid composition in brain of animal models of depression. After chronic unpredictable mild str

3、ess was used to induce depression model;body weight,sucrose preferences and open field were tested as depression behavioral;corticosterone concentrations in serum and phagocytosis of macrophages were measured to analyze the function of peripheral immune;gas chromatography was used to detect the comp

4、osition of f n-3 and n-6 fatty acids in the brain. Compared to controls,stress significantly decreased body weight,sucrose intake, horizontal movement and vertical movement of open field test,while the macrophage phagocytosis increased significantly. Furthermore,a decreased EPA,DPA and n-3/n-6 PUFAs

5、 were found in the brain of stress group. However,feeding EPA significantly improved the above abnormal changes caused by chronicstress. The research shows that chronic stress induces the changes of immune activation and PUFAs composition of cell membranes in rats. EPA can improve the depression-lik

6、e changes and the mechanism may be implicated in rebalance of immune activation of macrophage and composition of n-3 and n-6fatty acids in the brain.% 利用慢性不可预知轻度 应激诱导大鼠抑郁模型,以体质量、糖水偏好和旷场实验作为抑郁样行为评价指标, 以腹腔巨噬细胞吞噬能力、皮质酮激素水平为外周免疫和应激激素指标,测定脑内 多不饱和脂肪酸(PUFAs)探讨脑内细胞膜组成的变化结果表明:与对照组相比，应激 组大鼠在体质量、糖水偏好及旷场实验中穿越格数

7、和站立次数均有明显下降,而皮 质酮激素和腹腔巨噬细胞吞噬能力均显著增加，脑内n-3 PUFAs、n-3/n-6 PUFAs 减少，喂饲EPA可显著改善应激引起的变化.期刊名称】广东海洋大学学报年(卷),期】2017(037)001【总页数】7页(P88-94)【关键词】EPA；不饱和脂肪酸;炎症;抑郁症;慢性不可预知性轻度应激【作 者】 李玉玉;张才;薛红莎;刘白平;张永平;宋采【作者单位】 广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088;广东海洋大学食品科 技学院,广东湛江 524088;广东海洋大学食品科技学院,广东 湛江 524088;广东海 洋大学食品科技学院,广东湛江 524088

8、;广东海洋大学食品科技学院,广东 湛江 524088;广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088【正文语种】 中 文中图分类】 R749.4 日常生活中的各种压力或心理应激是抑郁症的主要诱因，慢性不可预知性温和应激 (Chronic unpredictable mild stress , CUMS )通过模拟日常生活中的各种压力 建立大鼠抑郁症模型，是目前广泛运用的抑郁症动物模型之一。应激可通过下丘脑-垂体-肾上腺轴( Hypotha la m us-Pitu ita ry-Ad rena l ， HPA ) 自主神经，边缘神经传导造成免疫失调。CUMS激活HPA轴释放大量肾上腺皮质 激

9、素(Glucocorticoid , GC)。正常条件下，GC可通过其受体抑制NF-kB(Nuclear factor-KB)炎症通道的活化，降低免疫细胞的炎症反应。而慢性应激 激活的过量的GC持续占据GC受体，破坏HPA轴反馈功能，激活巨噬细胞和小 胶质细胞M1亚型反应及持续活化NF-kB炎症通道，激活的巨噬细胞和小胶质细 胞可分泌大量的炎症因子和氧化自由基引发外周和中枢神经炎症1。炎症因子可 通过结合神经元上的白细胞介素的受体调节大脑功能；炎症因子亦可通过激活吲哚 胺2 , 3双加氧酶进一步刺激HPA分泌GC,加速5-HT和色氨酸代谢，减少脑内 5-HT合成，降低神经突触可塑性和再生引起神

10、经元的凋亡，进而引起焦虑、抑郁 症状2。在实验及临床研究也证实抑郁症患者和抑郁动物血中巨噬细胞活性增高， 白细胞介素等促炎因子含量上升3-5，表明炎症在抑郁症中扮演着重要的角色。 因此抗炎药物的研究可能是抗抑郁药研发的新方向。深海鱼类和微藻中均含有丰富的n-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids , PUFAs )。n-3和n-6多不饱和脂肪酸直接参与膜脂的构成，对于维持细 胞膜功能有着重要作用。n-3系列中EPA是天然抗炎物质，而n-6系列中AA 可代谢为类花生酸类花生酸是促炎因子前列腺素、白细胞三烯、血栓烷和促炎白细 胞介素的前体，可增强炎症反应6-7。临

11、床发现，在抑郁症患者体内n-3 PUFAs 明显下降，而n-6/n-3 PUFAs的比例上升8。慢性应激造成的抑郁样行为与抑郁 症病人症状相似，EPA是否改善慢性应激诱导的抑郁样动物的行为、免疫炎症以 及是否影响细胞膜中PUFAs的变化尚不明确。本实验利用CUMS诱导的大鼠抑郁模型，通过测定其行为学、应激激素、外周免 疫细胞的活性及脑内PUFAs组成变化，研究EPA的抗炎抗抑郁作用及可能机制， 以期为EPA应用于在抑郁症预防和治疗提供依据。动物健康、性成熟SPF级Wistar雄性大鼠购自广州中医药大学实验动物中心（250 280 g，合格证号：NO.44005800002878 ）。饲养条件：

12、大鼠2只/笼，温度 （22 2）C,湿度（50 10）%,12 h 光照（7:00一19:00）,自由摄食和 饮水。实验动物的饲养和操作规程遵守广东海洋大学实验动物饲养和使用相关规定。试剂 粉状基础饲料由广东医学实验动物中心加工提供，棕榈油（纯度100%）购自广州 果漾生物科技有限公司，EPA （纯度 85% ）购自苏州仁普药业有限公司，中性 红购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，二十三碳烷酸甲酯、MTT均购自 Sigma公司，培养基RPMI 1640购自Gibco公司，胎牛血清购自浙江天杭科技 有限公司， 37种混标及9种单个脂肪酸甲酯标品（ C23 ： 0 ， C18 ： 2n-6 ，

13、C18 ： 3n-6，C18：3n-3，C20：3n-6，C20：4n-6，C20：5n-3，C22：5n-3，C22： 6n-3 ）均购自美国NU-CHEK公司，甲醇、二氯甲烷、正己烷、氯仿、二氯甲烷、 无水乙醇、无水乙酸、二甲基亚砜购自成都市科龙化工试剂厂。动物分组 将30只大鼠随机分为3组：对照组（ CT ，喂饲质量分数5%棕榈油） ，应激组（S，喂饲质量分数5%棕榈油），应激+ EPA组（S + EPA,喂饲质量分数 1%EPA + 4%棕榈油），每组10只，各组大鼠体质量无显著性差异（P 0.05 ）。 EPA来源于天然食品成分，现广泛用于食品保健品中；本课题组以往研究证实相 等剂量

14、条件下EPA对正常饲养大鼠无副作用影响9-10，亦以节省动物的原则， 故本实验未设置EPA正常对照组。EPA和棕榈油按质量比例添加到粉状基础饲料， 搅拌均匀。为防止EPA氧化，饲料2 d制备1次,-20 C保存。应激方法参考Banasr等11的慢性不可预知轻度应激（CUMS ）抑郁症模型并做一定的改 动。具体为：42 d内大鼠每天随机给予2种不同应激，且3 d内不重复。应激源 为：4 C环境1 h，小鼠笼过夜（本实验过夜时间均为19 : 00至次日7:00）, 8C游泳10 min，束缚1 h,光照过夜，倾斜鼠笼45过夜，频闪光照过夜，拥挤 过夜，异味过夜，缺食/缺水过夜，3 h循环光照，湿垫

15、料过夜。体质量测定在42 d CUMS期间，每隔5 d对大鼠体质量测定1次，记录其体质量变化。糖水偏好实验在42 d CUMS实验后，第1天给予大鼠2瓶1%（质量分数）糖水（蔗糖）和充 足食物,第二天给予1瓶1%糖水、1瓶自来水和充足食物,第三天禁水禁食24 h 后给予1瓶1%糖水、1瓶自来水和充足食物，测试1h内糖水偏好量（实验时间 选择在大鼠活动频繁20:00 00:00,且保持环境黑暗）。按“糖水偏好度 = 糖 水消耗量/（糖水消耗量+自来水消耗量）x100%”计算糖水偏好度12。旷场实验旷场分析箱：直径1 m,高50 cm,内部为白色圆柱形，底部划分为25个方格。 实验时将大鼠头朝侧壁

16、放入箱内,观察 3 min 活动情况。记录指标：穿越格子数 站立次数。大鼠血清皮质酮测定大鼠断头牺牲取血，1 800 r/min，常温离心10 min，收集上清液并储存于-80C 冰箱中备用。按照大鼠血清皮质酮试剂盒说明书测定样品血清中皮质酮含量。巨噬细胞吞噬能力实验巨噬细胞的分离和培养：大鼠断头后，置于75% （申）乙醇中浸泡3 min，取出 后置于无菌托盘内，在无菌条件下用PBS反复冲洗腹腔，收集洗液约25 mL, 1 000 r/min离心10 min弃上清。用RPMI 1 640洗涤2遍，再用含10%小牛血 清和1%双抗的RPMI-1640培养液重悬细胞。细胞台盼蓝染色计数，保证细胞存

17、 活率95%以上，制成细胞悬液（1 x 106 个/mL ）。在96孔细胞培养板中，每孔 加入细胞悬液200 pL,于37 C、体积分数5 %二氧化碳培养箱中培养24 h。 巨噬细胞吞噬中性红活性测定：细胞培养24 h后，吸除上清，每孔加入200 pL 0.1%中性红溶液继续37C、5 %CO2培养箱孵育3 h后，吸除上清，用温生理盐 水洗涤2次，加入细胞裂解液（无水乙醇与无水乙酸体积11:）180 pL/孔,常 温裂解2 h , 570 nm测定OD值13。1.10脑内n-3和n-6 PUFAs的检测大鼠断头牺牲后，取脑-80C保存。脂肪酸的提取参考Folch14的脑组织脂肪酸 提取方法。脑

18、组织匀浆，加入10.5 mL氯仿/甲醇（体积比21:）溶液，加入C23 : 0为内标，涡旋后，加入2.6 mL的8.8 g/L NaCl溶液后，以500 r/min离 心20 min，取下层，氮吹仪下干燥称量质量。加入3.5 mL的1.5% （申）硫酸甲 醇溶液，1.5 mL二氯甲烷溶液,100 C水浴1 h进行甲酯化，然后加入3 mL正 己烷，1 mL H2O，充满N2后以盖密圭寸，涡旋30 s , 500 r /min离心2 min ; 吸取上层氮气下干燥,称量质量。按 10 mg/mL 加入正己烷稀释,用于气相测定 色谱分析条件：色谱柱为DB-23 （ 60 m x 0.25 mm x

19、0.15 pm）毛细管柱，载 气为N2 （ 99.999% ），流速1.8 mL/min，分流比150:,进样1 pL,进样器温 度为250 C,检测器温度260 C,氢气流速35 mL/min，空气流速350 mL/min。采用程序升温：50 C保留1 min后，以25 /minC升温至175 C,再 以 1 /minC升温至 200 C,保留 20 min。定性和定量：按照脂肪酸标准品的保留时间对样品各个色谱峰进行定性；采用内标 法计算各脂肪酸的实际含量（脑组织所含各种脂肪酸质量分数）。1.11 数据统计采用SPSS19.0统计分析软件，单因素方差分析（One-way ANOVA ）实验数

20、据， Bonferroni检验，结果以均值士标准误差表示，显著性水平a = 0.05。EPA对CUMS诱导的大鼠体质量变化的影响在42 d慢性不可预知性温和应激（CUMS ）期间，各组大鼠体质量变化如图1。 方差分析显示CUMS显著影响大鼠体质量。应激组（S ）体质量增长速度显著低 于CT组，而喂饲EPA后，S + EPA组大鼠体质量显著高于S组。EPA对CUMS诱导的大鼠糖水偏好变化的影响42 d CUMS后，糖水偏好实验结果如图2。结果显示，CUMS可显著影响大鼠对 糖水的偏好程度（F（ 2,28 ） = 11.222 , P 0.01）。应激组（S ）糖水偏好度 显著低于CT组（P 0.

21、05 ）；而喂饲EPA后,S+EPA组糖水偏好度显著高于S 组（P 0.01 ）。EPA对CUMS诱导的大鼠旷场行为变化的影响结果如图3所示。方差分析显示，CUMS显著影响大鼠穿越格数和站立次数（F（ 2,28 ） = 18.454 , P 0.01 ;F（ 2,28） = 7.407 , P 0.01 ）。应激组（S ） 大鼠与对照组相比，从表现出运动格数次数和站立次数显著降低（均为P 0.01 ）；而S + EPA组大鼠运动格数和站立次数均明显增加（分别为P 0.05 和 P 0.01 ）。EPA对CUMS诱导的大鼠皮质酮质量浓度变化的影响方差分析显示，CUMS显著影响大鼠皮质酮水平（F（

22、 2,22 ） = 18.454 , P 0.01）。应激组（S ）血清皮质酮激素浓度显著高于CT组（P 0.05 ）;而 S+EPA组皮质酮激素浓度显著低于S组（P 0.05 ）（图4）。EPA对CUMS诱导的大鼠巨噬细胞功能变化的影响方差分析显示，CUMS显著影响大鼠巨噬细胞吞噬能力（F（ 2,28 ） = 7.503 , PV 0.01)(图5)。与CT组相比，应激组(S )巨噬细胞显著被激活，吞噬活力 显著增强(P V 0.01 )；而喂饲EPA后其活力与S组相比显著降低(P V 0.05 )。EPA对CUMS诱导的大鼠脑内n-3和n-6 PUFAs含量变化的影响 利用内标法分析大鼠脑

23、组织n-3 PUFAs C18 : 3n-3(ALA), C20 : 5 n-3(EPA), C22 :5n-3( DPA ),C22:6 n-3 ( DHA),以及 n-6 PUFAs C18 : 2n-6(LA)，C18:3n-6(GLA)，C20:3n-6(DGLA)，C20:4n-6(AA )啲含量。表1可见，CUMS可显著影响大鼠脑内EPA(F( 2,24 )= 5.992 , P v 0.01 )、 DPA(F(2，24)= 130.089，P V 0.01)、n-3 PUFAs(F(2，24)= 4.761， P v 0.05 )及 n-3/n-6 PUFAs ( F( 2,24

24、) = 35.768 , P v 0.01)的水平。其 中S组n-3 PUFAs中EPA , DPA含量均显著降低(均为P v 0.05 )，总n-3 PUFAs及n-3/n-6 PUFAs均显著降低(P v 0.05 )，而喂饲EPA后均显著改善 其变化。喂食EPA后显著降低大鼠DGLA ( P v 0.05 ), AA及n-6 PUFAs的含 量(P v 0.01 )。本实验利用CUMS诱导的大鼠抑郁模型研究EPA的抗抑郁作用及可能机制。在42 d CUMS期间，应激组(S )体质量增长速度显著低于CT组，而喂饲EPA后， S+EPA组大鼠体质量显著高于S组，说明EPA可显著改善CUMS诱

25、导的抑郁动 物的体质量的变化。在糖水偏嗜度实验中，S组动物糖水偏好度较CT组明显降低， 表明动物经慢性应激后快感缺乏，而 S+EPA 组动物可以逆转应激造成的快感缺乏； 旷场试验中S组运动能力、探索能力与CT组相比均显著降低，喂饲EPA有助于 改善大鼠的运动探索能力。这些结果说明S组大鼠焦虑程度增加、兴趣减少，快 感缺乏，而长期喂饲EPA可显著改善CUMS诱导的大鼠抑郁样症状，与前人研究 结果趋势一致15。抑郁症患者巨噬细胞活性显著增强，促炎细胞因子增加16-17。本实验通过测定 大鼠外周免疫细胞的吞噬能力探索了大鼠巨噬细胞免疫功能的变化，结果证明了应 激后巨噬细胞炎症反应显著增强。而通过喂饲

26、EPA可显著降低应激引起的外周免 疫细胞的激活，巨噬细胞吞噬能力显著下降，显示出EPA的抗炎效果。GC过度分泌是抑郁症患者的一个重要指标，抑郁症患者早期伴随着GC的变化 18-19。本课题组已报道脑室注射IL-1P可刺激HPA轴，导致GC过度分泌造成 记忆障碍，而摄取EPA可减少GC的分泌，进而改善记忆20。本研究中CUMS 导致大鼠外周血清中皮质酮激素显著增加，与抑郁症病人症状一致。饮食给予 EPA可显著逆转CUMS导致的皮质酮激素的过度分泌，EPA对皮质酮激素分泌的 调节可能与其抗炎活性有关。Lee等21在探索n-3 PUFAs影响大脑内的炎症反 应途径时，发现钙依赖性细胞内磷脂酶A2 (

27、 cPLA2 )或分泌型磷脂酶A2 ( sPLA2 ) 释放的AA可以通过环氧合酶-2 ( COX-2 )转化为前列腺素E2 ( PGE -2)等一系 列花生酸类促炎介质22。Song等23已报道EPA可显著降低去嗅球导致的抑郁 样大鼠外周血中PGE-2 , IL-邛和皮质酮激素及下丘脑中cPLA2的浓度，且增加 海马中NGF表达。EPA可与AA竞争COX-2而抑制促炎介质PGE-2的合成，从 而起到抗炎作用24。报道显示EPA可能是通过抗炎途径对神经起到保护作用从 而改善抑郁症状25-26。EPA也可与GC的受体结合，抑制GC的功能，从而改 善CUMS导致的抑郁症状27。n-3和n-6 PU

28、FAs是细胞膜的重要组成部分，n-3和n-6 PUFAs相互合作和竞争， 共同保持细胞膜的功能。EPA和DHA与细胞膜中磷脂相互作用，可影响膜特性； 含有DHA和EPA的磷脂明显降低双层膜的厚度，增加细胞膜的流动性和提高膜 通透性。含有DHA或EPA的磷脂与脂筏相互作用，可增加胆固醇含量或胆固醇/ 磷脂比值，增加细胞膜的流动性28。本研究中CUMS导致大鼠脑内EPA、DPA 减少，而DHA变化不显著，且喂饲EPA后，EPA和其代谢物DPA显著增加，但 不改变DHA的水平。这些发现表明，在喂饲EPA后，DPA可能发挥作用重要作 用，但由于DPA在大脑中的功能意义尚未明确，还需要进一步研究。CUM

29、S导致 大鼠脑内n-3 PUFAs及n-3/n-6 PUFAs减少，而n-6 PUFAs减少不显著。在喂 饲EPA后，n-3 PUFAs及n-3/n-6 PUFAs均显著增加，而AA及其前体DGLA， 以及n-6PUFAs含量显著减少，进一步证明EPA可能是通过影响花生四烯酸（AA）的代谢而起到抗炎和免疫调节作用。抑郁症患者血中总n-3 PUFAs含量 下降25，老年抑郁症患者补充n-3 PUFAs两个月后，老年人情感状态抑郁评分 表评分和红细胞膜磷脂中的AA/ EPA的比例显著降低19。膳食中摄入鱼油也可 能通过影响PUFAs的代谢从而起到抗抑郁作用19。本研究结果表明，摄入EPA可以降低抑

30、郁样大鼠外周巨噬细胞的激活，减轻炎症 反应，进而减少皮质酮激素的分泌；EPA亦可改变大脑的多不饱和脂肪酸组成， 以通过影响花生四烯酸（AA ）的代谢而起到抗炎和免疫调节作用，从而改善抑郁 症状。后续实验需要进一步探索EPA在改善抑郁症的具体机制，为EPA在抑郁症 的预防和治疗方面提供理论依据。【相关文献】FRANK M G，THOMPSON B M，WATKINS L R，et al. Glucocorticoids mediate stress- induced priming of microglial pro-inflammatory responsesJ. Brain Behavior

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