大豆分子育种研究

1、大豆分子子育种摘要要: 不同同基因型型的大豆豆子叶节节在添加加适宜BBA 的的M SS 培养养基上培培养, 可从子子叶节诱诱导出高高频丛生生芽, 并获得得大量再再生植株株. 通过过农杆菌菌介导法法,将深黄黄被孢霉霉6- 脂肪肪酸脱氢氢酶基因因导入到到栽培大大豆吉林林43 和黑农农37品种种中. 经过在在含5000mgg鯨卡那霉霉素的筛筛选培养养基中连连续筛选选, 获得得一批转转基因植植株. 经PCRR 检测测和DNNA 分分子杂交交分析, 初步步证明外外源基因因已导入入并整合合到大豆豆基因组组中. 本文重重点阐述述了组培培再生系系统和基基因转化化系统的的内在联联系和不不同点.卜云云萍，李李明春

2、，胡国武武等，大大豆子叶叶节组培培再生系系统与农农杆菌介介导的基基因转化化系统的的比较研研究，南南开大学学学报(自然科科学版)，20003，36（1）：1003-1105摘要：用用 RAAPD 标记方方法对来来自中国国、日本本、韩国国、不丹丹、尼泊泊尔、越越南 66 国 1663 份份小豆种种质资源源 DNNA 的的遗传多多样性进进行检测测。从 27 个引物物共检测测到 2285 条带，有 2261 条具多多态性（占 992.998%），其中中野生型型多态性性带谱占占 855.822%，栽栽培型次次之为 83.52%，半野野生型为为 800.466%，三三类型小小豆都有有其自身身特征带带；遗传

3、传离散度度大小顺顺序是：野生型型半野野生型栽培型型，其遗遗传分化化系数大大小顺序序为：野野生型半野生生型栽栽培型；从分化化系数差差异看，半野生生型小豆豆更接近近野生型型小豆；从相似似系数平平均值来来看，半半野生型型小豆材材料之间间亲缘关关系较近近，而处处在进化化两极的的野生型型材料之之间、栽栽培型材材料之间间亲缘关关系都较较远；来来自我国国西南以以及日本本南部两两地区的的小豆材材料遗传传离散度度较大，遗传分分化系数数、相似似系数平平均值较较低。聚聚类分析析结果表表明，1163 个小豆豆材料以以遗传相相似系数数 0.32 为截值值，可分分为 88 大类类，归类类有较明明显的地地理相关关性及遗遗传

4、类型型的趋同同性。金文文林，文文自翔，濮绍京京等，应应用分分析小豆豆种质资资源遗传传多样性性及遗传传演化趋趋势，中中国农业业科学 20005,338(22):2241-2499摘要本本文研究究AFLLP技术术在大豆豆上的应应用,在在改进大大豆种子子DNAA提取方方法的基基础上,比较同同位素与与银染检检测方法法的效果果,筛选选适宜于于大豆AAFLPP分析的的酶切和和引物组组合,从从而建立立了适用用于大豆豆指纹图图谱快速速鉴定的的AFLLP操作作程序,并对我我国野生生大豆和和栽培大大豆代表表性材料料进行了了AFLLP分析析。近年来,大豆种种质资源源研究中中应用的的分子标标记大体体可以分分为两大大类

5、。一一类是以以分子杂杂交为基基础的RRFLPP技术,另一类类是以PPCR反反应为基基础的各各种DNNA分子子标记,包括有有DAFF、APP-PCCR、RRAPDD、SSSR、AAFLPP等技术术。作为为一种有有效的分分子标记记,RFFLP最最先被应应用到大大豆遗传传研究中中(Appuyaa等19988)1。但是是从建立立品种指指纹图谱谱来看,RFLLP技术术单个探探针信息息量少,鉴别效效率不高高2。RAAPD技技术以其其快速简简单的优优点被用用来鉴别别大豆种种质33,4,但由由于所采采用引物物Tm值值较低,扩增结结果易受受外界条条件的影影响。SSSR标标记在大大豆种质质研究中中应用也也较多5,

6、66,其其多态性性远远高高于RFFLP标标记,但但一次性性检测的的位点也也有限。因此,发展一一种既能能高度揭揭示遗传传变异多多样性,又相对对操作简简单的分分子标记记,对于于大豆指指纹图谱谱研究具具有重要要的意义义。分子标记记AFLLP(aampllifiied fraagmeent lenngthh poolymmorpphissm)是是由Zaabeaau和VVos(19993)发发明的7,88。它它基于对对基因组组DNAA进行双双酶切,片段末末端连接接上一个个接头,经一个个与接头头和邻接接酶切位位点相匹匹配的引引物进行行PCRR选择性性扩增,而后用用变性聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶分离扩扩增产物物。

7、这种种方法结结合了RRFLPP可靠性性和PCCR高效效性的优优点,已已经成功功地应用用于大豆豆遗传图图谱构建建与遗传传多样性性研究中中9,10,11。但是是该方法法受专利利保护,分析试试剂盒十十分昂贵贵,还需需要同位位素操作作,用叶叶片提取取DNAA手续较较多,也也影响到到分析的的效率,因此有有必要建建立适用用于大豆豆的优化化操作程程序。本研究旨旨在探索索大豆种种子提取取DNAA并用于于AFLLP分析析的可能能性,比比较银染染与同位位素技术术在检测测效率上上的相对对效果,筛选适适用于大大豆的酶酶切和引引物组合合,完善善大豆指指纹分析析的AFFLP技技术,为为大豆材材料真实实性和纯纯度检验验、种

8、质质亲缘关关系的研研究提供供方法。1.2.1DDNA的的提取关关于大豆豆DNAA的提取取,前人人多采用用叶片提提取的方方法。MMcDoonalld等(19994)12对DNNA提取取法进行行了改进进,从玉玉米、大大豆、棉棉花等种种子中提提出质量量较高的的DNAA。但是是,作者者在用该该法提取取大豆样样品,尤尤其野生生大豆时时,由于于色素及及酚类、醌类等等多糖类类杂质较较多,得得到的DDNA呈呈淡红、红色,十分粘粘稠,溶溶解困难难,2660/2280比比值较低低,而且且降解严严重,这这样会影影响DNNA样品品的酶切切效果。因此,本研究究在MccDonnaldd等基础础上作了了改进,详见结结果部分

9、分。大豆种子子DNAA提取方方法的改改进本研究在在McDDonaald等等(19994)122提取取DNAA方法的的基础上上,作了了以下改改进:栽培大豆豆取半粒粒或单粒粒种子,野生大大豆可取取1-22粒种子子,以确确保DNNA样品品的纯度度取干种子子,无须须在液氮氮条件下下研磨,即可保保证DNNA的完完整性；尽可能除除尽种皮皮,减少少种皮中中所含杂杂质对DDNA质质量的影影响提高SDDS提取取液的浓浓度,由由122%提高高到4%,以增增加DNNA产量量；第一次离离心采用用10,0000转/秒秒,以后后离心速速度降为为30000转/秒,以以防止DDNA的的降解；加入高浓浓度(33M)的的盐离子子

10、(KAAC),以去除除多糖类类及色素素等杂质质,对于于野生大大豆,还还加入PPVP或或巯基乙乙醇,以以防止酚酚类、醌醌类物质质对DNNA的降降解；增加酚/氯仿抽抽提步骤骤,而后后再用氯氯仿进一一步抽提提,以除除去杂质质和多余余的酚；加0.22l的110g/lRNNaseeA,在在4下过夜夜,以除除去RNNA,并并进一步步抽提,防止RRNA对对酶切的的影响。本研究单单粒野生生大豆提提取的DDNA量量约为33-200g,单单粒栽培培大豆提提取的DDNA量量约为110-2200g,而而一次预预扩增仅仅需DNNA1000ngg左右,所以完完全满足足测定所所需。与与叶片提提取方法法相比较较,直接接从种子

11、子中提取取DNAA,不需需发芽、光照培培养、液液氮研磨磨等过程程,可以以提高种种子的检检验效率率。银染法和和同位素素法检测测的总带带数相近近,但同同位素法法多态性性条带、多态性性百分率率较高,而银染染法平均均遗传多多样度(Haav)和和有效等等位基因因的数目目和略高高于同位位素法。鉴于银银染法结结果与同同位素基基本相似似,可以以避免放放射性同同位素使使用,而而且经济济快速,因而银银染法AAFLPP是可以以广泛应应用的。不同的酶酶切组合合和引物物组合,扩增结结果不相相同,本本实验通通过比较较不同酶酶切组合合,发现现EcooR -Msee 酶切切时较容容易找到到多态性性引物组组合,而而且具有有较高

12、的的多态性性。本研研究还证证实“3+33”引物组组合用于于大豆AAFLPP分析较较为理想想,同时时找到了了多对理理想的引引物组合合,可以以用于大大豆种质质的指纹纹分析研研究。通通常AFFLP检检测需要要使用放放射性同同位素标标记,而而且,一一般认为为,同位位素法比比银染法法更灵敏敏,尤其其使用333P标标记效果果较好14。本研研究证实实,用同同位素333P检检测所得得到的带带型上下下较为均均匀,分分辨率较较高;银银染法带带型较粗粗,对不不同分子子量的条条带染色色深浅不不甚一致致,容易易出现分分辨率上上高下低低的情况况,因而而需要更更多的技技巧。本本研究通通过比较较还证实实,银染染法与同同位素法

13、法除在一一些弱带带判别上上有一定定出入外外,所得得到的带带型基本本一致。在实际际应用中中,不同同方法的的检测效效率是与与研究者者所掌握握的技术术水平和和熟练程程度紧密密联系的的。只要要充分掌掌握各个个技术环环节,银银染法可可以在避避免放射射性污染染、降低低成本的的同时,同样得得到分辨辨率较高高的指纹纹图谱。田清清震，盖盖钧镒，喻德跃跃，大豆豆DNAA扩增片片段长度度多态性性(AFFLP)研究，大豆豆科学，220000,199(3)：2110-2217摘要:利利用大豆豆栽培品品种科丰丰1号和和南农111388-2杂杂交得到到的重组组近交系系,通过过、和4种分分子标记记的遗传传连锁分分析,构构建了

14、包包含244个连锁锁群、由由7922个遗传传标记组组成的大大豆较高高密度连连锁图谱谱,该图图谱覆盖盖23220.77,平均图图距2.9。标记记的多态态性较高高,在基基因组中中的位置置相对稳稳定,可可以作为为锚定标标记,有有利于连连锁群的的归并和和不同图图谱的比比较整合合;而标记对对于增加加图谱密密度效率率较高,但其容容易出现现聚集现现象,从从而造成成连锁群群上有很很大的空空隙()。另外外,在连连锁群中中有211.7%的分子子标记出出现偏分分离。该该图谱为为基因定定位、比比较基因因组学和和重要农农艺性状状的定位位等研究究打下了了基础。分子标记记连锁图图为进行行植物基基因组的的结构分分析和比比较提

15、供供了有力力的工具具。较高高密度的的分子图图谱已有有效地应应用于数数量性状状基因定定位()、图位位克隆基基因、比比较基因因组学研研究和分分子标记记辅助育育种等研研究中。因此,对于具具有重要要经济价价值并得得到广泛泛研究的的大豆作作物来说说,发展展一张高高密度的的遗传连连锁图将将具有重重大意义义。遗传传作图中中最常用用的分子子标记有有、和标记。然而,对大豆豆而言,有两两个缺点点:一是是的多多态性程程度不高高,二是是大豆的的大多数数标记记为多个个位点。标记记虽然过过程简单单,但多多态性低低且重复复性较差差。微卫卫星标记记()多多样性高高而位点点基本单单一稳定定,所以以利用标标记作为为锚定标标记,则

16、则有助于于图谱的的连锁群群或染色色体的归归并和不不同连锁锁群的整整合。技术结结合了和的的特点,在一次次反应中中能同时时检测多多个遗传传位点,在大豆豆中平均均一个泳泳道有5501120条条带,信信息量非非常丰富富,并且且标记记能够填填补其他他标记之之间的空空隙。所所以适合合用于构构建饱和和的分子子遗传图图谱研究究。大豆遗传传图谱的的发展已已经有了了10多多年的历历史。119888年等首次次用标标记构建建大豆遗遗传图谱谱,但是是此图谱谱的标标记仅为为11个个,组成成4个连连锁群1。随后,等用用.种间杂杂交作为为构图群群体,构构建了一一个图图谱,包包括由1130个个标记记组成的的26个个连锁群群,覆

17、盖盖大豆基基因组1120002。和将来来源于不不同群体体的各种种标记整整合到一一张连锁锁图谱上上3。他们们用栽培培大豆杂交交的近等等基因系系再杂交交的22代群体体构建了了含有113个经经典标记记、7个个同工酶酶标记、1100个标标记和88个标标记的遗遗传图谱谱。通过过使用一一套锚定定的探探针,根根据这些些位点点在和.作图群群体中的的分离情情况,确确定分子子标记和和经典标标记图谱谱间的连连锁群同同源性。后来等利用用 10014437.6544构建的的含有3300个个单株的的群体,构建了了饱和度度较高的的遗传图图谱,该该连锁图图谱含有有28个个连锁群群,长度度为34441,共共有1665个标记、2

18、5个个标记记和6550个标记。尽管经常成成簇排列列,相对对于其他他分子标标记,更均匀匀地分布布在所有有连锁群群中44。等等将6006个单单一位点点的标记记整合到到连锁图图谱上,这套标标记作为为锚定标标记,将将3个不不同群体体的连锁锁图谱整整合为一一个公共共图谱5。该图谱谱包括114233个不同同类型的的分子标标记,其其中有6606个个标记、6899个标标记、779个标记、11个个标记记、100个同工工酶标记记和266个经典典标记。由于标标记是单单一位点点,不仅仅增加了了遗传图图谱中分分子标记记的数目目,同时时根据不不同图谱谱上的公公共的标标记,使使连锁群群数目减减少到220个,这与大大豆染色色

19、体数目目相吻合合。如今今在所有有图谱上上共检测测出29950个个位点。3.1图谱构构建构建高密密度遗传传图谱是是大豆基基因组研研究的重重要内容容之一。等55应用用6066个标记记补充已已构建的的3张图图谱使其其所包含含的单一一位点的的总数达达到14423个个,包括括6066个,6689个个,779个,111个,10个个同工酶酶和266个经典典性状标标记,建建立200个保守守连锁群群,但仍仍有几个个小连锁锁群( ,544,24)不能整整合进去去。我们们在构建建高密度度大豆遗遗传图谱谱时,主主要借助助于标记记进行锚锚定连锁锁群,利利用标标记加密密图谱。标记由由于其优优点是可可以用来来进行连连锁群的

20、的锚定,使图谱谱间的比比较易于于进行。虽然构建遗遗传图谱谱的效率率比较高高,但是是由于平均每每对引物物在两个个亲本间间可以检检测到665条带带,平均均可产生生10.6条多多态带,在进行行不同图图谱比较较或者用用于筛选选分子标标记时,应用起起来比较较不便。最近,由于分析软软件的出出现和配配套技术术的完善善已经可可以做到到在1周周的时间间内,对对700000条条带进进行基因因型分析析122。如如果将不不同的群群体的亲亲本同时时进行标标定,这这样可以以准确地地将信息息量非常常大的整合到到公共连连锁图谱谱上,这这对于建建立高密密度的公公共连锁锁图谱是是非常有有益的,也有利利于基因因的精细细定位。目前番

21、番茄和大大麦等作作物的整整合的图谱密密度已经经低于1113,14。本研研究构建建的大豆豆分子遗遗传图谱谱有244个连锁锁群,共共计7992个标标记,是是国内最最为致密密的图谱谱。目前前大豆遗遗传图谱谱构建的的缺憾是是还没有有将大豆豆的连锁锁群与对对应的染染色体联联系起来来。这主主要是因因为大豆豆的基因因组是复复杂的古古四倍体体起源。大豆多多基因家家族含有有两个独独立亚组组的发现现也证明明了这一一点115。不过随随着大豆豆全套(20个个)初级级三体的的应用,这200个连锁锁群与大大豆200条染色色体的对对应关系系将很快快能够确确定。3.2偏分离离现象偏分离现现象普遍遍存在17。高密密度分子子连锁

22、图图谱的构构建,为为在整个个基因组组中调查查表现偏偏分离的的位点提提供了可可能118。有人认认为由于于遗传搭搭车效应应,与影影响偏分分离的遗遗传因子子紧密连连锁的分分子标记记则表现现有严重重偏分离离166。目目前还有有另外两两种假说说解释偏偏分离现现象,一一种认为为是配子子体选择择的结果果,22群体中中偏分离离的比例例为021(亲亲本1正常亲本22)。另另外一种种观点认认为是花花粉选择择的结果果,这种种模式的的偏分离离位点在在群体中中以011的比比例分离离133。张张德水等等6利用栽栽培品种种(.)长农农4和半半野生种种(.)新新民6的的2代代群体以以及刘峰峰等77利用用同一对对亲本的的群体进

23、进行了大大豆分子子图谱构构建和基基因组分分析,研研究表明明绝大多多数偏分分离标记记都偏向向于栽培培品种长长农4,雄配子子体选择择是标标记偏分分离的主主要影响响因素。在本研研究中,虽然偏偏分离的的标记数数高达221.77%,但但没有发发现明显显偏向于于某一亲亲本的趋趋势。这这里的偏偏分离可可能主要要与遗传传搭车效效应有关关,当然然也不排排除个别别配子体体选择现现象。标记聚集集()和标记记空隙()构建遗传传图谱都都期望标标记间距距尽可能能小,并并且标记记在基因因组上应应均匀分分布。但但是,我我们构建建的连锁锁图谱上上的分子子标记,在每个个连锁群群上的分分布并不不是均匀匀的,很很多标标记聚集集在一起

24、起,形成成122个集聚聚区,相相应地增增加了聚聚集区以以外的标标记间距距,从而而形成比比较大的的空隙区区域()。分子子标记的的聚集现现象在番番茄113、大麦14、玉米米199、甜甜菜220、马铃薯薯211和大大豆44等作作物中都都有报道道。据推推测在番番茄、大大麦和玉玉米上+标记记的聚集集区域是是着丝点点附近的的异染色色质区,但是在在大豆、甜菜和和马铃薯薯上还不不能肯定定这种聚聚集区是是在异染染色质区区。和和22发现异异染色质质区的联联会丝复复合体上上的重组组节频率率比常染染色质的的低。等13发现番番茄图谱谱上+标记记在聚集集区中的的比例与与异染色色质区中中的比例例(777%)是是一致的的。在

25、我我们构建建的连锁锁图谱上上,699%的标记存存在于聚聚集区中中。+标记记的聚集集现象可可能与异异染色质质区重组组率低有有关。所所以利用用对甲基基化敏感感的限制制性内切切酶代替,可以以在非甲甲基化的的常染色色质区识识别酶切切位点,而不是是在异染染色质区区。这样样虽然+标记记虽然少少,但是是要比+标记记分布均均匀,+标记记在水稻稻群群体中分分布比较较均匀23。因此此,要根根据不同同研究目目的选择择的限限制性内内切酶。在大多多数研究究中,特特别是定定位,+标记记更合适适。但是是这种标标记系统统往往受受基因型型和植株株发育的的影响,因为基基因组甲甲基化程程度随着着基因型型和植株株发育状状态不同同而变

26、化化。在基基因精细细定位和和图位克克隆基因因时,要要根据基基因处于于异染色色质区还还是常染染色质区区,来选选择合适适的标标记。例例如番茄茄抗病基基因 9位位于常染染色质区区,精细细定位采采用+标记记244。而而位于异异染色质质区的番番茄抗病病基因图位位克隆采采用了+标记记255。在等55构建建的大豆豆图谱上上,也发发现了若若干标标记和标标记的密密集区,如:.图谱中中的11连锁锁群,上上部166个标记记中,113个为为标记记,相邻邻的有111个和和18个个标记组组成的两两个密集集区,中中间被88个标记记(其中中包括77个标标记)隔隔开。由由于标标记均来来自基因组组克隆,因为是对甲甲基化敏敏感的内

27、内切酶,这些克克隆大多多为单拷拷贝或低低拷贝,可能并并不是随随机分布布于整个个基因组组中,因因此他们们推测,标记密密集区很很有可能能与位位点而不不是位点点有关。在本图图谱中有有些连锁锁群仍存存在分子子标记分分布不均均匀现象象,甚至至有的存存在大于于20的空空隙。这这主要与与图谱上上的大多多数标标记聚集集现象有有关。另另外,也也可能是是因为所所用亲本本之间在在某些染染色体区区段缺乏乏多态性性,某些些染色体体结构发发生了大大的变异异,导致致在这一一段染色色体上分分子标记记不能用用连锁规规律定位位。等5在在构建高高密度大大豆遗传传图谱时时也遇到到同样的的问题,为了在在空隙间间找到标标记,他他们利用用

28、空隙两两边的作探针针,筛选选库,但但是在空空隙间很很难找到到合适的的标记。因此发发展来源源于不同同杂交组组合的作作图群体体,以及及发展包包括微卫卫星标记记,标标记,标记等等新型分分子标记记都是填填补图谱谱中的缺缺口,构构建覆盖盖整个基基因组的的遗传图图谱的有有效手段段。3.4基因定定位构建高密密度的遗遗传图谱谱和筛选选与基因因紧密连连锁的分分子标记记是图位位克隆基基因的前前提。大大豆连连锁群上上含有多多个抗性性基因,如抗花花叶病毒毒病基因因1、抗抗花生斑斑点病基基因1和和抗蚜虫虫根腐病病基因33266,最最近又报报道大豆豆抗细菌菌枯病基基因1也也定位在在这个区区域55。因因此,大大豆连连锁群的

29、的构建和和抗性基基因密集集区的精精细作图图对于图图位克隆隆抗性基基因将具具有重要要意义。另外,我们将将抗大豆豆花叶病病毒基因因的标标记定位位在连连锁群、控制花花色的基基因和和绒毛有有无基因因定定位于1连锁锁群。抗抗花叶病病毒基因因和定位位正在进进行中。吴晓晓雷，贺贺超英，王永军军等，大大豆遗传传图谱的的构建和和分析，遗传学学报，220011，288(111):11051110061王晓晓丹，吕吕慧颖，张敬等等，以PPCR为为目的的的大豆叶叶片DNNA提取取方法的的比较研研究，分分子植物物育种，20004,22(6)：8991-8894PCR 反应的的性质决决定其对对模板DDNA 的纯度度要求不

30、不十分严严格。因因此, 许多实实验室发发展了适适合于不不同作物物的模板板DNAA 快速速分离法法1- 。用用叶盘PPCR 法筛选选转化体体, 省省去不必必要的报报告基因因序列, 以减减少有害害的变异异, 是是植物转转化实用用化的发发展趋势势4 。我们们用花粉粉管通道道法进行行大豆基基因转移移获得了了大量待待筛选的的种子, 用特特异引物物通过 PCRR 技术术初步筛筛选转化化体, 具有简简便、快快速、经经济等优优点。但但由于样样品数量量大, 模板DDNA 的分离离成了决决定筛选选效率的的关键环环节。尤尤其是如如何解决决大批量量小样品品的研磨磨问题至至关重要要。经过过反复探探索, 用自动动螺钉旋旋

31、具改制制成微量量样品研研磨器, 在 1. 5m l的微微量离心心管内研研样, 解决了了大豆鲜鲜组织的的大批量量小样品品的无损损耗快速速研磨问问题, 并简化化了DNNA 提提取的程程序, 收到了了很好的的效果。本文报报道具体体的操作作程序和和结果。微量样品品研磨器器的改制制用中国机机械进出出口总公公司生产产的自动动螺丝批批(螺旋旋棘轮螺螺钉旋具具)改制制微量样样品研磨磨器。将将产品配配带的三三个十字字花形的的转头在在砂轮上上磨一下下, 使使之与微微量离心心管的下下部形状状(圆锥锥形) 相吻合合。样品的制制备 取单株株收获的的大豆种种子, 每株 4- 5 粒粒, 放放入 550m l 离离心管内内

32、发芽(将离心心管挤牢牢在饭盒盒等容器器内, 每次可可处理数数十份), 228两到三三天。取取下胚轴轴和胚根根 0. 1- 0. 2gg(或生生长在大大田的大大豆幼苗苗的未展展开叶 0. 1- 0. 2g)放入 1. 5m l微量量离心管管内, 将离心心管放入入液氮中中冻几秒钟钟后置工工作台上上, 将将微量研研样器的的转头放放入离心心管并迅迅速按动动手柄数数次。样样品研好好后将转转头取出出, 用用镊子或或硬毛刷刷剔出转转头沟槽槽中的样样品, 用蒸馏馏水涮洗洗两次, 然后后用干净净纱布擦擦净转头头(或更更换转头头)可进进行下一一个样品品的操作作。研好好的样品品放入冰冰中或- 200备用。提取缓冲冲

33、液成分分 试验采采用两种种提取缓缓冲液: SDSS: 1100mmM TT riis- HCll(pHH 8. 0) , 5000mM N aaCl, 500mM EDTTA , 1. 255% SSDS。 CTAAB: 1. 0% W VV CTTAB, 0. 7MM N aCll, 110mMM EDDTA , 550mMM T riss- HHCl(pH 8. 0) ,0. 1% 巯基基乙醇。DNA 提取程程序 a. 每管加加入 5500uul 在在 655水浴中中预热的的 SDDS 提提取缓冲冲液, 混匀; b. 放入 65- 800水浴中中, 颠颠倒离心心管数次次, 放放出管内内冷气

34、, 保温温 5- 200 分钟钟; c. 每管加加入 1150uul 55M KKAC, 混匀匀, 冰冰浴 110 分分钟并不不断混匀匀; d. 4, 1100000 RRPM , 离离心 110 分分钟; e. 将上清清移入另另一离心心管内, 加入入等体积积的氯仿仿异戊醇醇(244 : 1) , 快快速颠倒倒离心管管直至形形成乳状状液不再再很快分分层; f. 4, 880000 RPPM 离离心 55 分钟钟; g. 小心将将上清移移入另一一离心管管中, 加入 2 倍倍体积的的冷乙醇醇, 混混匀, 放置 5- 10 分钟; h. 4, 1100000 RRPM 离心 10 分钟; i 倒倒掉

35、上清清, 用用 700% 乙乙醇洗管管壁和沉沉淀两次次, 将将离心管管倒置在在纸巾上上, 干干燥 220- 30分分钟; j. 每管加加入 2200uul TTE 缓缓冲液溶溶解沉淀淀。1微量量样品研研磨器的的效果中国机械械进出口口总公司司出品的的螺旋棘棘轮螺钉钉旋具的的转头的的直径和和长度与与 1. 5mm l的的离心管管最为匹匹配, 用其改改制的微微量样品品研磨器器效果最最好。快快速按动动手柄, 转头头的转速速可达3300 RPMM 左右右, 转转头上的的十字沟沟槽与离离心管壁壁形成较较大研磨磨力, 使经液液氮冷冻冻的样品品很容易易被研碎碎。研磨磨一个样样品只需需 0. 5- 1 分钟。大

36、豆下下胚轴经经液氮冷冷冻后较较硬, 如用国国产离心心管容易易破裂, 需用用进口离离心管进进行研磨磨。叶片片、幼苗苗等不太太硬的样样品可用用国产离离心管,以降低低成本。 本文的的大豆模模板DNNA 分分离程序序, 只只用氯仿仿异戊醇醇抽提一一次, 并且提提取时间间可缩短短到5 分钟, 是目目前最简简单、快快速的方方法。用用该程序序每天可可处理近近百个样样品(取取决于离离心机转转头的孔孔数)。程序中中两个关关键步骤骤是: 氯仿抽抽提时应应反复颠颠倒离心心管(330 秒秒钟以上上)直至至停止时时形成的的乳浊液液不很快快分层; 最后一一步DNNA 溶溶解时, 体积积不能太太小(1100- 2000ul

37、l)。体体积太小小, 溶溶解困难难, 并并影响 PCRR 扩增增的效果果。我们们用 00. 11- 00. 22g 的的样品量量, 最最后溶解解体积为为 2000ull, 再再稀释 10- 500 倍用用作模板板, PPCR 扩增的的效果很很好。周思思君，小小样品大大批量大大豆模板板DNAA 快速速分离法法，大豆豆科学，19999，118(44)：3318-3211应用从660000多份大大豆种质质资源中中筛选出出的211个抗大大豆花叶叶病毒病病的品种种或品系系及7个个感病的的品种或或品系,选用220个随随机引物物,对总总DNAA进行了了随机扩扩增。有有18个个引物扩扩增得到到了稳定定的RAA

38、PD图图谱,OOPH-06和和OPHH-100未能扩扩增到RRAPDD产物。扩增出出的片段段分子量量在0.6-44.6KKb之间间。随机机引物扩扩增出的的条带数数在5-17条条之间,共扩增增出1665个条条带,品品种间相相同的条条带有1104个个,多态态性条带带有611个,多多态性条条带占337%。这200个引物物可分为为1无扩扩增产物物的引物物;2扩扩增产物物无多态态性的引引物;33扩增产产物多态态性低于于15%的引物物;4扩扩增产物物多态性性在155%-330%之之间的引引物;55扩增产产物多态态性在330%-50%之间的的引物;6扩增增产物多多态性超超过500%的引引物。依依据遗传传距离

39、进进行聚类类分析的的结果表表明,这这些材料料可以明明确地聚聚成5组组。各组组内姊妹妹系衍生生出的品品种或品品系首先先聚在了了一起,其次有有一定血血缘关系系的聚在在了亚组组里。另另外,各各组内或或亚组内内的品种种或品系系在地理理分布上上具有一一定相关关性。RAPDD反应20个110-mmer随随机引物物购自OOperron公公司,所所用引物物的编号号为OPPH-001-OOPH-20,其碱基基序列参参见Opperoon100-meerkiitsprooducctinnforrmattionn。所用用随机引引物的GG+C含含量为660-770%。扩增反反应在225l体积积中进行行,其中中模板DDN

40、A22l(55ng/l),随机引引物2l(550moll/L),2.5mMMdNTTPs22l,110 xbbufffer22.5l,TTaqDDNA聚聚合酶11u,超超纯水116.55l,上上面覆盖盖20-30l液体体石蜡。热循环环条件为为:944变性11分钟,35退火22分钟,72延伸22分钟,5个循循环。接接着9440.55分钟,351分钟钟,7221.55分钟,40个个循环,然后772延伸110分钟钟。扩增增产物在在1.44%琼脂脂糖凝胶胶,1TAEE缓冲液液中电泳泳,经EEB染色色,在紫紫外灯下下观察结结果并照照相。RAPDD技术方方法简单单,耗费费少,效效率高,已应用用于生物物学研

41、究究的各个个领域。如:染染色体组组图谱分分析(WWillliamm等,119900);基基因定位位(Paarann等,119911;Maartiin等119911;Uppofff等,119922);染染色体标标定(QQuirros等等,19991),品种种鉴定(Hu等等19991),遗传变变异性分分析及系系统进化化研究(K.GG.Laark等等,19992,19993;II.Teerryy等,119955;T.Milllann等,119966)。一一般而言言,理想想的标记记应具备备以下几几个特点点:1高高度的多多态性;2容易易使用;3数目目丰富;4确切切可靠。对于RRAPDD,前三三点是其其引

42、起人人们注意意并予以以广泛应应用的突突出属性性。至于于可靠性性,RAAPD确确实很敏敏感,反反应体系系及条件件稍有变变化,便便会对其其结果产产生影响响。所以以应保持持DNAA模板浓浓度,引引物浓度度,Mgg+2浓浓度,热热循环反反应条件件相同,TaqqDNAA聚合酶酶批次一一致。就就本实验验而言,试验均均进行22-3次次重复,重复性性很好,结果是是可靠的的。就某类特特异种质质资源,在栽培培品种(或品系系)间,应用RRAPDD进行遗遗传变异异性分析析,这方方面的报报道很罕罕见。本本研究聚聚类分析析结果与与亲缘关关系,地地理分布布的吻合合性,证证实了RRAPDD用于种种内品种种间遗传传变异性性分析

43、的的可行性性。利用聚类类分析不不同组间间的,遗遗传距离离较大的的广谱抗抗源做为为杂交亲亲本,利利于拓宽宽遗传基基础,在在育成品品种中积积聚抗性性基因,形成持持久抗性性。而利利用不同同组间的的遗传距距离较大大同时抗抗性表现现差异又又大的材材料做为为杂交亲亲本、配配制杂交交组合,形成的的分离群群体中,分子标标记多态态性表现现的水平平将较高高,利于于构建分分子标记记框架图图谱,定定位抗性性基因。张志志永，陈陈受宜，盖钧镒镒等，栽栽培大豆豆品种间间RAPPD标记记的多态态性分析析及聚类类分析，大豆科科学，119988，177(1)：1-8大豆属(Glyycinne)中中有2个个一年生生种:野野生大豆豆

44、(Gllyciine sojja SSiebb.ett Zuucc.)和栽栽培大豆豆Gllyciine maxx (LL.) Merrr.。普遍遍认为一一年生野野生大豆豆是栽培培大豆的的祖先,在野生生大豆向向栽培大大豆的演演化过程程中,其其形态、生理性性状发生生了明显显的变化化,植株株由蔓生生变为直直立,籽籽粒由小小变大。这些性性状的变变化是在在人工选选择的作作用下向向着有利利于人类类的方向向发展的的。关于于大豆的的演化、起源问问题,前前人在形形态、农农艺性状状等方面面进行了了大量研研究。近近年来一一些研究究者运用用生化、分子标标记研究究大豆的的遗传演演化和多多样性问问题33,4,8,99,111。但但由于方方法和材材料的局局限性,尚未能能得出全全面结论论。为此此,本研研究在扩扩大样本本代表性性的基础础上,分分析了中中国野生生大豆和和栽培大大豆的等等位酶标标记、细细胞器DDNARRFLPP标记和和细胞核核DNAARAPPD标记记,目的的在于寻寻找和大大豆进化化有关的的遗传标标记性状状,分析析野生大大豆和栽栽培大豆豆的遗传传多样性性水平差差异,为为深入研研究大豆豆的演化