动物细胞培养原理

1、2.2.2.2 饲养细胞制备在杂交瘤细胞的培养过程中，融合后大量骨髓瘤细胞和脾细胞在 HAT 培养 液中相继死亡，此时单个或少数分散的细胞不易存活，必须加入其他细胞方能使 之生存，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。一般选用正常小鼠的腹腔巨噬细胞 作为饲养细胞。在细胞融合前的 1 天制备饲养细胞。将健康的 Balb/c 小鼠眼球放血后拉颈脱臼处死，浸泡于 75%酒精中 消毒35min,随即放入超净工作台内，腹部朝上固定于解剖台板上。用镊子提起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，暴露一小块腹膜，再换 把剪刀将暴露的腹膜剪一个小口。用滴管吸取适量的不完全RPMI-1640培养液注入小鼠腹腔。反复抽吸、 冲洗

2、腹腔34次。( 4)抽回腹腔内液体，注入离心管内。lOOOrpm 离心 10min,弃上清。先用5ml HAT培养液将沉淀细胞悬浮并混匀，做细胞计数，根据细胞 计数结果，补加HAT培养液，使细胞浓度为2x105个/ml。将细胞悬液加入96孔培养板内，每孔100 m然后将培养板置37C、5% CO2细胞培养箱内培养。该项操作及以后的操作都必须严格无菌操作。2.2.2.3 脾细胞的准备取已经免疫的 Balb/c 小鼠，摘除眼球放血，并分离血清供检测抗体时 的阳性对照用。同时将小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精中5min，随即放入 超净台内。在小鼠腹壁上剪一小口，撕开皮肤，用灭菌镊子提起腹膜，剪开左

3、侧 腹膜及肋骨，暴露脾脏，换用另一套灭菌器械，用镊子提起脾脏，分离结缔组织， 取出脾脏。放入盛有5ml不完全培养液的平皿中，轻轻冲洗一次。再将脾脏移入另一盛有 5ml 不完全培养液的平皿中，再冲洗一次，然 后用剪刀剪碎。将脾脏碎块装入匀浆器中，充分研磨。之后用不完全培养液冲洗匀浆 器，待大的组织块沉降后，吸取上层的细胞移入50ml离心管中，加不完全培养 液至30ml，混匀。1000rpm离心5min，弃去上清。沉淀细胞再用不完全培养液同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬至 10ml，混匀。取脾细胞悬液活细胞计数后备用。2.2.2.4 SP2/0 骨髓瘤细胞的准备 骨髓瘤细胞的状况直接影响融合结果，

4、生长良好的细胞透亮，边缘光滑清晰。在细胞融合前一周左右复苏SP2/0骨髓瘤细胞，并在细胞融合前36 48h 将骨髓瘤细胞扩大培养。使细胞在融合时正处于对数生长期。一般融合一次 用的细胞数是长到95%左右的75mm2培养瓶4-5瓶。融合时将SP2/0骨髓瘤细胞从瓶壁上吹下，收集于50ml离心管内。lOOOrpm离心5min,弃去上请。用不完全培养液混悬细胞后活细胞计数，取所需细胞数，用不完全培 养液洗2次，以10ml不完全的RPMI-1640培养液悬浮备用。2.2.2.5 细胞融合将已制备好的脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞混合于灭菌的50ml离心管中，两 种细胞之比为10： 1, lOOOrpm离

5、心8min,弃上清，重复上述离心一次后尽量弃 去上清。用手指轻轻弹击离心管底部，使沉淀的细胞松散均匀。将离心管倾斜， 一手均匀地转动离心管，另一手用1ml吸管匀速加入1ml 37C预热的50% PEG, 从加入到加完的时间控制在60s左右，边加边搅拌。加完后，慢慢摇晃30s，再 静置60s。立即在随后的5min内加入10ml预热的37C不完全培养液，使PEG 稀释而失去促融作用。在第一分钟和第二分钟分别加1ml,第三分钟和第四分钟 分别加入2ml,第五分钟将剩余液体加完。边加边轻轻搅动使PEG和终止液充 分混合，动作应轻柔。随后再补加30ml不完全培养液，800rpm离心6min,弃 去上清，

6、加入10ml HAT培养液，轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀。根据 所用96孔培养板的数量，按一块96孔细胞培养板10ml计算补加完全培养液之 所需量。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，每孔100卩1., 37C、 5% CO2细胞培养箱内培养。融合后的第三天更换培养液一次，换液时吸去 1/2 培养液，加入等量新鲜 HAT 培养液。以后每隔两天换液一次。观察骨髓瘤细胞都死后，大约第七天左 右可以换用HT培养液。仔细观察融合细胞的生长状况，凡有污染的孔应立即滴 加1%的NaOH,以免污染扩散，如果细胞生长太慢可补加1次饲养细胞。 2.2.2.6 杂交瘤细胞的筛选融合后，一般过七天开始

7、寻找并记录杂交瘤的生长情况，当杂交瘤细胞长至 一个视野的一半以上时，可用建立好的间接ELISA方法检测抗体分泌情况，筛 选阳性克隆。取细胞培养上清100卩1加入已包被好抗原的酶标板中，细胞培养孔 补加100卩1培养液，其中两孔加入SP2/0培养上清作为阴性对照。两孔加入稀释 1000倍的多抗血清作为阳性对照，被检测孔OD值大于阴性孔4倍以上判定为 阳性。阴性孔3天后再检测一次，如仍为阴性则弃之。融合比较好的阳性孔应该 与阳性对照相近的。检测的阳性孔杂交瘤细胞立即全部转入24孔细胞培养板培 养。1 天后观察细胞生长良好即可用于克降化。2.2.2.7 杂交瘤细胞的克隆杂交瘤细胞克隆化的方法有很多种

8、，如有限稀释法、软琼脂平板法、单细胞 显微镜操作法和荧光活细胞分类法，我们所采用的是有限稀释法。一般第一次克 隆化时，用HT培养液稀释。制备饲养细胞。可于克隆化前一天制备，也可于克隆化当天制备。将待做克隆化的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后，取少许细胞悬浮至 另一无菌青霉素小瓶中。细胞计数并根据计数结果，对细胞悬液做适当稀释。取130个活细胞悬浮于6.5ml(终体积)培养液中此时平均每0.1溶液中含2 个细胞，接种96孔培养板，每孔0.1ml,共36孑L。这样就用去3.6ml。余下2.9ml, 再加入2.9ml培养液，共5.8ml(此时平均每0.1溶液中含1个细胞)，接种此细胞 液至其次的36

9、 孔,每孔0.1ml。最后剩余细胞悬液2.2ml，再补加培养液2.2ml(此 时平均每0.1ml溶液中含细胞0.5个)，接种最后的24孔，每孔0.1ml。这样共以 三种不同的细胞浓度进行克隆化，第一组36孔，平均每孔5个细胞，第二组36 孔，平均每孔1个细胞，第三组24孔平均每孔0.5个细胞。将培养板置5%CO2、37C孵箱中培养。一般5d左右(在此之前不换液) 即可在倒置显微镜下观察细胞克隆生长，注意确定单克隆细胞株。适时进行换液及检测。有多孔阳性时，应尽可能取单克隆孔继续进行再 次克隆化，同时转入24孔板，继而转入培养瓶中进行扩大培养,直至所有细胞孔 的培养上清液均为阳性。2.2.2.8

10、杂交瘤细胞的冻存和复苏细胞冻存每次克隆均要冻存510个阳性杂交瘤细胞株。选择生长旺盛、形态良好的 处于对数生长期的细胞，轻轻将细胞从瓶壁上吹下，1000rpm离心10min,弃上清， 收集细胞沉淀；用冻存液(20%小牛血清，70%不完全培养液，10%DMSO)将 细胞沉淀悬浮，分装于冻存管中，加盖封严，并注明细胞代码、冻存日期。冻存 液最好预冷，操作动作要轻柔、迅速。将冻存管先4C放置1h，之后-20C放置 1h,最后放入-80C长期保存。细胞复苏准备一个干净盛有37C温水的烧杯，自-80C冰箱中取出一只冻存管，立即 放入盛水的烧杯中，细胞部分浸入水中融化，1000rpm离心5min，而后移入超 净工作台，无菌开启冻存管，吸去上清，加入1 mlRPMI-1640完全培养液重悬细 胞沉淀，移入细胞培养瓶中，再加入46ml RPMI-1640完全培养液，置37C、5% CO2细胞培养箱内培养。2.2.2.8.3 腹水的制备采用体内诱生腹水法制备。选择812周龄小鼠，将0.5ml高压灭菌的液体 石蜡注射到小鼠腹腔，以促进腹腔内营养物质的分泌和聚集。一周后取大瓶培养 的处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞株，1000rpm离心10min,弃去上清液，用 不完全培养液悬浮细胞