利用液相色谱法测定中药的柚皮苷含量

1、利用液相色谱法测定中药的柚皮苷含量摘要】目的建立HPLC法测定常见中药中柚皮苷的方法，测定常见中药中柚皮苷 含量。方法 Waters Symmetry C18柱(4.6x150mm,3.5um)，流动相为甲醇:乙腈： 磷酸缓冲液(0.01mol/L pH3.5)=9:3:8，检测波长为280nm。结果柚皮苷的出峰 时间为2min,柚皮苷1.80350mg/L范围内具有良好的线性关系，R2值为 0.9999，平均回收率分别为 99.5%-102.5%，相对标准偏差小于 5%；香橼、枳实和 橘红的柚皮苷含量分别为 2.89-5.67%、0.21-0.26%、11.97-2.44%，不同产地的香 橼

2、、枳实、橘红中柚皮苷含量的相对标准偏差分别为28.88%、10.63%和26.42%; 四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒和抗骨增生丸中柚皮苷的含量分别为 5.99mg/g、 2.25mg/g、1.71mg/g、0.30mg/g，不同厂家生产的四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒 和抗骨增生丸中柚皮苷浓度的相对标准偏差分别为8.43%、 14.72%、 9.90%和 3 . 42% 。结论建立了一种简便、准确、适用性广泛地测定中药中柚皮苷的方法， 产地对香橼及橘红中柚皮苷含量的影响较大，而不同厂家生产的中成药中柚皮苷 的含量偏差相对较小。【关键词】高效液相色谱法 柚皮苷 中药 原料 中成药Determinati

3、on of naringin in Chinese medicine byhigh-performance Liquid Chromatographic Method(XUE Bai-yun, DUAN Ci-qun)(Peopleshospital of Yingtan City, Jiangxi Province, Yingtan, 335000) 【Abstract】 Aim: To set up a quantitativehigh-performance liquid chromatographic method for determination of naringin and t

4、o investigation naringin content in common Chinese medicine. Method: An RP-HPCL method was set up, using Symmetry C18 column, methyl alcohol: acetonitrile:PBS(containing 0.01mol/L postassium dihydrogan phospate pH=3.5)= 18:3:14 as mobile phase with a flow rate of 1.0ml/min at the detection wavelengt

5、h of 210nm. Result: retain time was about 2min, naringin well separated with other compositions. The Calibration curve was ofgood linearity in the range of 1.80350 mg/L with R2 0.999, recoveries were range from 99.5%-102.5%, relative standard derivation was less than 5%. Naringin content in Citron,

6、Citrus aurantium, and orange-red were 2.89-5.67%, 0.21-0.26%, and 11.97-2 .44%, respectively. Relative standard derivation of naringin contents from different origin were 28.88 for citron, 10.63 for citrus aurantium, 26.42 for orange-red. Naringin content in 4 soup, stomach pain pill, orange pill bo

7、ne particles and anti-proliferative Pill were 5.99 mg /g, 2.25mg /g, 1.71mg /g, and 0.30mg /g repectively. Relative standard derivation of naringin contents from different factory were 8.43 for 4 soup, 14.72 for stomach pain pill, 9.90 for orange pill bone and 3.42 for anti-proliferative pill. Concl

8、usion: This method is accurate, sensitive and convenient for detecting naringin content of Chinese medicine, Origingreatly effects naringin content of the citron and orange-red ,whereas, naringin content of Chinese patent medicine are little affected by origin.【Key words】 High-performance Liquid Chr

9、omatographic Method, naringin, Chinese medicine, raw material, Chinese patent medicine柚皮苷是一种二氢黄酮类化合物，它又称柚苷、柑桔苷、异橙皮苷、柚皮素- 7-O-新橙皮糖苷，学名为柚皮素-7-B-D-葡萄糖(2T1)-a-L-鼠李糖，分子式 C27H32O14，分子量580.551。相关研究表明，研究表明，柚皮苷在降血脂2、 抗氧化3、抗菌消炎4、抗肿瘤5、抗过敏6、抗关节炎镇痛7、抗心血管疾 病8及其他多方面9具有较强的生物活性，是骨碎补、枳实、枳壳、化橘红等中 药10的主要有效成分之一。柚皮苷的含量是衡

10、量这类中药的重要指标之一，目前定量测定柚皮苷的方法 有分光光度计法11，高效液相色谱法12，分光光度计法不能排除结构类似物的 干扰，很难精确定量；密度较差，干扰因素过多；虽然液相色谱已经广泛用于测 定中药中的柚皮苷，但这些方法大多数都是针对某一种中药中的柚皮苷含量的测 定，方法的适用性受到限制。因此，开发一种具有较广泛用途的中药柚皮苷测定 方法，对于利用液相色谱法分析定量柚皮苷含量，以此评价中药质量的具有重要 的意义。材料与方法1.1 仪器与试剂Waters 高效液相色谱仪（包括 Waters 1525 BinaryhPLC 泵， Waters 2487 紫外 检测器，Waters Syste

11、m Breeze数据处理工作站）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪 器厂）；eppendorf离心机。香橼、枳实、橘红购于樟树药材市场；四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒和抗骨增生 丸分别购自不同的医药批发公司。柚皮苷标准品（sigma公司）；甲醇、乙腈、四氢咲喃（色谱纯，美国TEDIA 公司）。样品处理标准品溶液的制备精确称取柚皮苷标准品0.0048g,溶于甲醇并定容至10ml，分别用甲醇稀释制成一定浓度的标准溶液。样品溶液的制备称取一定量的实验样品，粉碎过100 目筛，烘干至恒重，称取 1g 先用乙醚进 行索氏抽提去除脂肪类物质，再用 50mL 丙酮浸提，共浸提3 次，合并 3 次浸提 液，旋转蒸发浓缩

12、至干，加入50mL的甲醇溶解并定容至200mL，再经0.45ym针 头式微孔过滤器过滤后备用。色谱条件色谱柱为Symmetry C18柱，流动相是甲醇:乙腈:磷酸缓冲液（0.01mol/L pH3.5）=9:3:8 （V/V），流速 1.0ml/min，检测波长 280nm，柱温 35C。结果与分析方法的定性分析图1 是柚皮苷标准品及7 种分析样品的色谱图。由图1 可知，柚皮苷的出峰 时间为 2min 左右，所试验的 7 种中药的杂质峰与柚皮苷的峰得到了较好的分离 说明方法的适用性较好。图1 样品的 HPLC 色谱图Fig 1.HPLC chromatogram of samples注：图中

13、A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H 分别是柚皮苷标准品，枳实、橘红、香 橼、四磨汤、橘红丸颗粒、胃痛丸、抗骨增生丸的液相色谱图。标准工作曲线及检测限精密吸取柚皮苷的标准样品的梯度稀释样，在选定的色谱条件下进样20山进 行分析，以柚皮苷的浓度（mg/L ）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线， 并计算其回归方程。结果表明，在 1.8-350mg/L 的浓度范围内，柚皮苷分析测定 的标准工作曲线的回归计算方程为y=42381x，回归方程的R2值为0.9999，说明 在此浓度范围内线性关系良好。基线噪音峰面积响应值为6110，以3 倍噪声计算 检测限，则柚皮苷的检测限为0.43mg/L；

14、以10倍噪声计算方法的定量检测限， 则最低定量检测浓度为 1.44mg/L。准确度 采用回收率进行方法准确度的评价，分别称取不同柚皮苷标准品，用丙酮提 取，浓缩后用甲醇溶解定容，用液相色谱测定其浓度，以计算其回收率,结果如表 1 所示。由表 1 可知，在 1.44-328.75mg/L 浓度范围内，柚皮苷的回收率处于 99.53%-102.14%之间。表1回收率试验结果Table 1 Result of recovery test2.4精密度分别以 4 种中成药为本底，加入一定的柚皮苷，用液相色谱检测，每个样品 溶液 5 个平行样，计算相对标准偏差，结果如表 2 所示。相对标准偏差都小于 5%

15、，说明样品的精密性良好。表 2 样品精密度实验结果Table 2 Result of precision experiment注：样品 1 是以抗骨增生丸为本底；样品 2 是以四磨汤为本底；样品 3 是以 橘红丸颗粒为本底，样品4是以胃痛丸为本底。几种原料中药柚皮苷含量的测定对市售的几种原料中的柚皮苷含量进行测定，结果如表 3 所示。由表 3 可知 不同原料药中的柚皮苷浓度差别较大，香楷中柚皮苷含量为2.89-5.67%，不同产 地香橼的柚皮苷含量差别较大，其相对标准为 28.88%；枳实中柚皮苷的含量为 0.21-0.26%，不同产枳实中柚皮苷含量的相对标准偏差为10.63%；橘红中柚皮苷

16、的含量为 1.97-3.31%，不同产地橘红中柚皮苷含量的相对标准偏差为 26.42；这说 明，产地不同的原料药中柚皮苷的浓度具有较大的差异，这种差异在香橼及橘红 中非常明显。表3几种原料药中柚皮苷含量测定结果Table 3 analysis results of naringin content of law Chinese medicine几种中成药柚皮苷含量的测定对市售的几种原料中的柚皮苷含量进行测定，结果如表 4 所示。由表 4 可知 四磨汤中柚皮苷的含量为5.99mg/g，胃痛丸中柚皮苷含量为2.25mg/g，橘红丸颗 粒中柚皮苷含量为1.71mg/g，抗骨增生丸中柚皮苷的含量为0.

17、30左右。不同厂家 生产的四磨汤、胃痛丸、橘红丸颗粒和抗骨增生丸中柚皮苷浓度的相对标准偏差 分别为 8.43%、14.72%、9.90%和3.42%，与中药原料中柚皮苷的含量差异较大相 比，不同厂家生产的中成药中柚皮苷含量相对稳定。表4几种中成药中柚皮苷含量测定结果Table 4 analysis results of naringin content of Chinese medicine结论3.1建立了利用液相色谱法测定中药中柚皮苷的方法，用Symmetry C18柱， 在甲醇：乙腈：磷酸缓冲液(0.01mol/L pH3.5)=9:3:8 (V/V)、流速 1.0ml/min、 柱温35

18、C的条件下进行分离，在280nm波长条件下检测，柚皮苷的出峰时间为 2mi n,柚皮苷与杂质得到了很好的分离。方法的标准曲线回归方程为：y=42381x； 方法的检测限为0.43mg/L，定量检测浓度为1.44mg/L；柚皮苷的回收率在99.5%- 102.5%之间,相对标准偏差小于 5%。几种含柚皮苷的中药原料中，香橼中的柚皮苷含量最高，枳实中含量相对 较低；不同产地的中药原料中柚皮苷的含量并不相同。几种中成药中柚皮苷的含量差别较大，其中四磨汤中柚皮苷含量相对较高 不同厂家生产的中成药中柚皮苷的含量相对较稳定。参考文献贾冬英.柚皮苷提取纯化及其络合改性研究D.四川大学硕士论文,2002.Bo

19、k SH, Lee SH, Park YB, et al. Plasma andhepatic cholesterol andhepatic activities of 3-hydroxy- 3-methyl-glutaryl-CoA reductase and ethyl CoA: cholesterol transferase are lower in rats fed citrus Peel extract or a mixture of citrus bioflavonoidJ. J Nutr., 1999, 129(6):1182-1185.Limasset B， Doucen CL, Dore JC, et al. Effects of flavonoids on the release of reactive oxygen species by stimulatedhuman neutrophils: Multivariate analysis of structure-activity relationships J. Biochemical Pharmacology, 1993， 46(7):1257-1271.Jeon SM, Bok SH, Jang MK, et al. Comparison of antioxidant eff