医学实验内参的选择

1、实验内参，即是在检测细胞内分子表达变化时选择的参照物，其在细胞内的表达 相对恒定，在处理因素作用条件下不会发生表达改变的基因。内参同样可以校正 上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。1、管家基因最普通的内参是内源性参照基因，也就是管家基因（持家基因，house keeping gene）。管家基因是一类始终保持着低水平的甲基化并且一直处于活性转录状态的基因， 高度保守并且在大多数情况下持续表达。其表达水平受环境因素影响较小，而且 是在个体各个生长阶段的大多数，或几乎全部组织中持续表达，或变化很小，因 此常存在于生物细胞核的常染色质中。它的表达只受启动序列或启动子与RNA 聚合

2、酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。管家基因维持细胞最低限度功能所不可少的基因，如编码组蛋白基因、编码核糖 体蛋白基因、线粒体蛋白基因、糖酵解酶的基因等。这类基因在所有类型的细胞 中都进行表达，因为这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不 可少的。*NM_OO11O1 Homo sapiens actin beta (ACTS) mRMAGGBB叫閘 00OD34 Homo sapiens aldolase A fnjc lose - b is phosph a te (ALOOA) mRNA3425VjM_002046 Homo sapiens giyceraidenyde-3

3、-ph06pnate dehydrogenase (GAPD) mRrJA828*N(J_00029l Homo sapiens phosphogycerate kinase PGK1) mRHA2727*r-lM_005566 Homo sapiens lactate dehydrogenase A (LOHAj mRNA21057jm_002954 Homo sapiens ribosomal protein S2?a(RPS27A) mRriAJi56JNM_OOO981 Homo sapiens ribosomal protein L19(RPL19). mRNA6997*?1_000

4、975 Homo sapiens ribosomal protein L11 (RPL11) mRNA6060*NM_007363 Homo sapiens non-POU domain 匚ontaining octamEnbinding (NONO). mRNA1 ?0&*NM_004309 Homo sapiens Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha (ARHGDIA) mRNAi35B*NM_000994 Homo sapiens ribosomal protein L32 (RPL321 mRNA9523*NM_O22551 Homo

5、sapiens ribosomal protein S18 (RPS1B) mRNAH2&1tNM_007355 Homo sapiens near sncxK 90kDa protein 1 oeta (HSPCB). mRNA4H9部分人类管家基因列表2、内参基因选择的条件1、不存在假基因，以免基因组DNA的扩增；2、高度或中度表达，避免太高或太低的丰度；3、稳定表达于不同类型的细胞和组织中，表达量无明显差异；4、表达水平与细胞周期、活化等无关；5、不受外源性或内源性因素的影响。3、不同管家基因在选择管家基因作为内参时，首先要按不同类型的分子选择正确的内参。曾看到有人用检测miRNA时选择

6、了 GAPDH作为内参呢。a、检测mRNA时的内参通常使用的是 GAPDH、beta-actin、tubulinGAPHDGAPDH是糖酵解反应中的一个酶，由4个3040kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家(house keeping)基因，几乎在所有组织中都高水平 表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分 识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA, poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。beta-actinp-Actin (ACTB)是PCR常用的内参，0-Actin抗

7、体是Western Blot很好的内参 指数。p-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞 骨架微丝的主要成分，具有收缩功能，分布广泛。另外，不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。比如一些少量特殊 的情况下，如脂肪组织或细胞内，0-Actin的表达量就很少，不适合做内参。tubulintubulin (微管蛋白)是球形分子，有两种类型:a微管蛋白(a-tubulin)和0微管 蛋白(0-tubulin),这两种微管蛋白具有相似的三维结构，能够紧密地结合成二聚 体，作为微管组装的亚基。a亚基由450个氨基酸组成，0亚基是由455个氨基 酸组成，它们的分子量约5

8、5 kDa。由于0-Tubulin的检测分子量大约在55kD，因此该内参抗体不是很适合用于检 测50kD-60kD大小目标蛋白的WB实验中。b、检测蛋白时的内参检测蛋白时，常用蛋白内参有GAPDH、0-Actin、0-tubulin。选择的内参要跟目 标蛋白分子量差5KD以上，所以需要根据目标蛋白的分子量来进行内参的选择。检测核蛋白时的内参当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用组蛋白H(Histone H)，或者核纤层蛋白(nuclear lamina protein)等为核内参抗体。组蛋 白的基因非常保守,在亲缘关系较远的种属中，四种组蛋白(H2A、H2B、H3、H4) 氨

9、基酸序列都非常相似,H1序列变化则很大。除了这些，其它常见的核蛋白内参 还有 K70, K80, Lamin A和 B，在一些文献报道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。但是需要注意的问题是核蛋白内参的 选择需要考虑实际的试验环境，比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自 身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内 参。反之，组蛋白Hist one H2A.X及Histo ne H3.1等由于是染色体的组成型表 达组分，表达比较稳定，经常被作为最广泛的核内参使用。另 NUCLEIC ACI

10、DS RES.上是用 a-Tubulin , RESEARCH DIAGNOSTICS INC专门提到a-Tubuli n。(胞浆表达，存疑)c、检测miRNA时的内参small nuclear RNA (snRNA)和 small nucleolar RNA (snoRNA)长度与 miRNA相 近，200bp左右，在多种组织细胞中高表达，不涉及miRNA的调节途径，且与 miRNA探针设计方法相同，所以snoRNA是很好的内参选择。Endogenous control genes recommendedsnoRNA assays: 18, ta and 5 for human, mouse

11、 and rat, resp. Human: U6. RNU48, RNU44, U47n and RNU6BMouse: snaRrJA-202. snoRNA-234, snoF?NA420-Least variable miRNA genesHuman/mouse tissues. miR-152, -186. -25. -92, -26b, -16Human/mouse cell lines miR-374T *16, -93. -156, -26b, -92-18S rRNA or U6常用内参简单介绍一下常用的内参U6： U6是一类snRNA，它是由RNA聚合酶山转录。主要形成小核

12、核糖核蛋白颗粒，定位与细胞核内，表达稳定。d、检测IncRNA时的内参检测IncRNA时，内参选择和mRNA 样，可以选择GAPDH、beta-actin等。GAPDH虽然在很多细胞实验中都很稳定，但是因为它是个糖代谢相关酶,在很多 糖代谢变化的实验中都会剧烈变化，比如缺氧、缺血、糖尿病以及某些肿瘤细胞 中。因此内参不是绝对的。同样，beta-actin也不是绝对的，如果涉及到细胞骨 架重排，解聚，重组的实验，beta-actin 一样不可靠。如果不确定，可以多选几 个内参候选，找一个变化量小的。最后，18S rRNA也可以作为IncRNA检测时 的内参。当然，还有其他的内参可以作为IncRNA检测的内参，如：RPL13Ae、检测circRNA时的内参检测circRNA时可以用18S rRNA作为内参。18S rRNA是一类核糖体RNA，所常用来进行生物分类的依据。由于18SrRNA 在生物中的表达比较保守，所以目前也用来作为内参。用18s RNA作为RT-PCR的内参，应该和0-actin是一个道理，半定量的目的 是要看总RNA中的目的基因mRNA的表达量，内参的目的是去除一些