双皮质素课件

1、主讲学生: 许文强兰州大学 神经科学研究所Neuroscience Research Institute, LanzhouUniversityEmail: 双皮质素DCX一、DCX（doublecortin，双皮质素）是一种微管相关蛋白，在哺乳动物神经系统的发育中广泛地表达，而且是神经元迁移和分化所必需的，其抗体可用来特异性标记新生神经元的胞质和突起。dcx: 双皮质素; X 连锁(双皮质素) doublecortex; lissencephaly, X-linked (doublecortin)分布: 细胞骨架|微管关联复合体(microtubule associated complex)

2、活性: 微管结合 参与: 细胞内信号转导级联|中枢神经系统发育|细胞分化 病变: 无脑回畸形(平滑脑), X 连锁|皮层下层状发育异常,Xq22.3-q23（X染色体长臂上2区2带3亚带到3带）摘自人类基因组计划人类基因组计划 微管相关蛋白（microtubule associated proteins MAPs）分子至少包含一个结合微管的结构域和一个向外突出的结构域。突出部位伸到微管外与其它细胞组分（如微管束、中间纤维、质膜）结合。MAP的主要功能是：促进微管聚集成束；增加微管稳定性或强度； 促进微管组装。 神经元的迁移（辐射迁移） 哺乳动物的脑在发育过程中发生显著的细胞结构变化，通过有丝分

3、裂，神经元前体细胞产生神经元，新生神经元接受外部刺激信号，通过胞内分子的信号传递，最终将信号汇集于细胞骨架上，通过细胞骨架网格成分如微管蛋白和动力蛋白丝的动力学重组来完成微丝和微管的动态变化，引起细胞有利于迁移的形态转变，最终沿着特定的路径迁移很长的距离，到达它们的终点位置。 大脑皮质从内向外的发育：较早分化的较大神经元先迁移并形成最内层，依次顺序向外；而较晚分化的较小神经元则通过已形成的层次迁移并形成其外侧新的层次；故不论皮质的什么区域，其最内层总是最早分化，而最外层则最后分化。2. 神经元分化 新生神经元的迁移越过了外层已形成的层次，到达特定位置后，神经元特化出轴突和树突，神经元胞体两端生

4、长出树突及轴突，轴突定向生长延伸至靶细胞部位，末端与靶细胞形成突触连接，树突发生分支，最终，新生神经元从形态及功能上发育分化成熟,并形成外侧新的层次。3. 神经元迁移的细胞机制 神经元迁移：微管轨道，微管相关蛋白促进重建和稳定，动力蛋白复合体卡车，细胞核沿着微管向前运动。 尽管神经元迁移有不同的方式和路径，然而所有迁移神经元的都要经历三个基本的细胞学事件。迁移神经元经历的三个基本的细胞学事件 2）DCX蛋白结合到微管上并刺激微管蛋白聚合发生。 dcx基因编码的微管相关蛋白双皮质素，它的表达主要发生在皮质发育期处于有丝分裂期后的神经元中（新生神经元），及迁移的神经元和轴突结构中。3）DCX基因中

5、的错义突变会影响相关蛋白与微管的正确结合，故对于神经元迁移和轴突伸长非常重要。 DCX基因突变会导致X相关联的无脑回畸形（症状：皮层光滑，厚实，精神缓慢迟钝，痉挛，寿命短等）。三、DCX与成体神经发生在哺乳动物成体的中枢神经系统中，有2个区域已被证明存在神经元前体细胞的增殖： 1）侧脑室的亚室带(SVZ) 2）齿状回颗粒细胞层下区(SGZ) 在这两个区域新生的神经元都要经过迁移到达特定位置，然后分化为成熟神经元，并与周围神经组织功能性的整合。以前，对于成体神经发生的研究主要靠一些标记增殖细胞的技术来完成，如有丝分裂的标记物Ki-67 或PCNA、逆转录病毒感染，和核苷酸类似物的应用，像溴脱氧尿

6、苷（BrdU）。在这些技术中，系统的BrdU处理是神经发生中应用的最广泛的，然而这个技术存在着一些缺陷：1）随着细胞的连续分裂，BrdU的浓度被稀释，标记就会效果下降；2）高剂量的BrdU会对组织产生毒性，过低剂量的BrdU又会导致不完全标记；3）反转录病毒和BrdU标记技术都要求在活体内对增殖细胞进行标记，而不能体外标记。5）DCX表达细胞的数量可以表示齿状回中细胞增殖水平，而且，在外界因子的刺激下，仍可以通过DCX表达细胞的增加或减少来体现细胞增殖水平；6）它不需要预先对活体内的增殖细胞进行标记，可以直接在体外对DCX抗原进行定位、定量标记；7）DCX可被用于分析特定区域、以及在正常和病理

7、条件下的神经发生的水平。在成体动物的神经发生中，DCX的表达始于成神经细胞的产生，在第二周达到最大，并随着神经元的成熟其表达被抑制。五、DCX免疫组化染色1. 剥琼脂 体式显微镜下，左手执手术刀，右手执小画笔，剥时尽量使海马完整，通常情况下，留下部分海马外围的脑皮质及脑干部分。但片子不能太大以免相互重叠而影响后面的抗体结合。2. 3%H2O2 封闭内源性过氧化氢酶，30-50min，用30%的H2O2 和0.1MPB配制，现用现配，注意30%原液不可在高温、强光环境下长久暴露，以免发生分解反应。用完后尽快放回-20冰箱保持。一般情况下每孔500微升。3. PB 610min，将H2O2吸去，加

8、0.1MPB洗6个10分钟。4. 加入1AK：goat-anti-DCX，通常情况下，用1AK原液（原液是纯净物比例为1）加1AK稀释液配制，比例为1:1000。一般情况下每孔500微升。4摇床过夜（12小时），注意加封口膜，以防抗体挥发。5. 回收1AK：goat-anti-DCX后，用PB洗330min6. 加入2AK：Rabbit-anti-goat-biotin 通常情况下，用2AK原液（原液是纯净物比例为1）加2AK稀释液配制，比例为1:200400，浓度大于1AK液。一般情况下每孔500微升。4摇床过夜（12小时）或者室温摇床4小时，注意加封口膜，以防抗体挥发。7. 回收2AK：用PB洗330min 8. Streptavidin（连霉亲和素）孵育， 室温摇床1h至1.5h 原液为纯液，一般配制比例1:200500，每孔500微升。9. PB 330min 25min10. 室温下DAB孵育10min 现用现配，用0.1MPB配制：比例为100l（DAB）：7ml （0.1MPB）= V ：n ml，（若每孔加1ml配制好的DAB，则n表示n个孔）。注意，DA