实验二银耳多糖含量的测定

1、关于实验二银耳多糖含量的测定第1页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三一、实验目的学习和掌握多糖含量测定的原理和方法。第2页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三三、实验原理多糖在浓硫酸中水解，进一步脱水生成糖醛及其衍生物，与蒽酮（10-酮-9,19-二氢酮）反应生成蓝绿色复合物，在620nm处有最大吸收值。以标准葡萄糖溶液作标准，在620 nm波长处进行比色，可计算出总糖的含量。第3页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三（1）糖经浓无机酸处理后，脱水生成糠醛或糠醛衍生物；第4页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三（

2、2）糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸的作用下，能与蒽酮化合物反应生成有色物质。 （3）反应液颜色的深浅，反映出糖浓度的高低。第5页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三四、仪器、试剂与药品试剂：0.1mg/ml的葡萄糖标准品、蒽酮试剂、蒸馏水 样品液：0.5 mg/ml试管、电炉、可见光分光度计、容量瓶 etc.第6页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三五、实验操作1、标准曲线的制作(1) 加样：(2) 将加好的样品混匀，沸水浴10 min，室温冷却，于620 nm处比色。(3) 以第一管为空白，进行比色。以光密度（OD值)为纵坐标，糖的含量(g)数为横坐标，得

3、标准曲线。第7页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三2. 样品的准备称取适量样品，先加少量的水溶解，最后定容于50 ml，至溶液浓度约为0.5 mg/ml.3. 样品中多糖含量的测定分别吸取0.1、0.3 和0.5 ml样品液，用蒸馏水补足1.00 ml。加入蒽酮试剂，同标准曲线制作之操作，比色测定。根据标准曲线和样品浓度计算含量。第8页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三第9页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三六、思考题1、根据样品液多糖含量，计算实验一中多糖的提取率。2、根据蒽酮测糖原理，设计测定化合物中淀粉量的方案。第10页，

4、共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三注意事项：加样要求准确。第11页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三实验三 猪胃粘膜中提取胃膜素、胃酶第12页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三一、实验目的学习从猪胃粘膜中提取胃膜素、胃酶的原理和方法，了解有机溶剂分级沉淀法的应用。第13页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三二、简介胃膜素 ：功效：一种以黏蛋白为主要成分的生物活性药物，有极强的黏附作用，可直接作用于消化道内壁，在胃及十二指肠溃疡面形成一层保护膜，减少胃酸对它的刺激，利于溃疡面的愈合；另一方面有润滑作用，使进入消化

5、道的食物易于在消化道内移行，有利于减少某些物质对溃疡面的刺激。胃膜素临床上用于胃及十二指肠溃疡。性质描述: 淡黄色或淡灰色粉末，或微小颗粒。着水胀为粘浆。显微溶状态，略带类蛋白胨臭。具有很强的粘附力。 第14页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三胃蛋白酶：存在于动物胃液中，以无活性的胃蛋白酶原形式，存在于胃底的主细胞中，在酸性条件下，胃蛋白酶原变化成有消化蛋白质能力的胃蛋白酶。在医学上主要用于治疗消化不良、食欲不振、慢性胃炎等，工业上可作水解蛋白用。干燥的胃蛋白酶为白色或淡黄色粉末，引湿性强，易溶于水；对热较稳定，100 10 min不破坏。水溶液中，70 以上破坏。第15

6、页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三三、实验原理胃粘膜一般指胃底粘膜，分泌胃液的主细胞集中在胃底粘膜，呈暗红色，直径约10-12厘米圆块，约100 g。胃膜素是从猪胃粘膜经胃蛋白酶和盐酸消化后的上层液中，60%左右的乙醇所沉淀的部分。蛋白质、酶等极性物质的水溶液加入与水混溶的有机溶剂，可沉淀析出。第16页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三四、仪器、试剂与药品 水浴锅，搅拌器，冰箱，真空干燥，盐酸，氯仿，丙酮，乙醇，离心机等。第17页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三四、实验操作1.激活提取猪胃粘膜0.55 Kg（5只猪肚）+水约

7、220 ml升（胃粘膜的40%），用1：1盐酸调pH 2.5-3.0，45-50 搅拌提取3 h (在搅拌的过程中需注意不停的调节pH)。2.脱脂分层双层纱布过滤，冷却至室温，缓慢加入约55 ml氯仿（胃粘膜的10 %），搅拌2 h，室温静置24 h后，放掉底层的氯仿和杂质，上清液预冷至5以下 第18页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三3. 胃膜素分离上清液在搅拌下（同一方向，否则胃膜素会散开）缓缓加入预冷至5以下的丙酮（=0.708）至比重约0.97，捞出胃膜素，以适量的75%乙醇洗两次，真空干燥。4.胃酶的沉淀母液再加丙酮至比重约0.91，有黄色沉淀产生，离心（4,

8、7000 rpm, 10 min)取沉淀，70以下真空干燥。第19页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三实验四 胃蛋白酶活力的测定第20页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三一、实验目的学习和掌握以牛血红蛋白为底物的胃蛋白酶活力测定的原理和方法，掌握紫外分光光度计的使用。第21页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三二、实验原理胃蛋白酶能催化水解芳香环氨基酸连接的肽键。在一定条件下，可定量催化水解牛血红蛋白产生不被三氯醋酸（TCA）所沉淀的酚基氨基酸（如酪氨酸）。酪氨酸在275nm波长处有最大吸收，以酪氨酸为对照，可以求出胃蛋白酶活力。

9、 第22页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三三、仪器、试剂与药品水浴锅，紫外分光光度计，酪氨基，盐酸，三氯醋酸，牛血红蛋白等。第23页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三四、实验操作1、对照品溶液的制备：精密称取经 105 干燥至恒重的酪氨酸适量，加盐酸溶液取1 mol/l盐酸溶液65 ml，加水至1,000 ml 制成每1 ml 中含0.5 mg 的溶液，摇匀，备用。2、供试品溶液的制备：精密称取实验三提取的胃酶干粉40-60 mg，用上述盐酸溶液制成每1ml 中约含 0.2 0.4U 的溶液。（称本品（一般3500U/g以上）40-60mg，用上述

10、盐酸溶液定容至100 ml，再取5 ml用上述盐酸溶液定容至50 ml，即0.04-0.06 mg/ ml）。第24页，共26页，2022年，5月20日，22点10分，星期三3、测定方法：取试管6 支，其中3 支各精密加入对照品溶液1ml ，另3 支各精密加入供试品溶液1ml ，置370.5 水浴中，保温5 分钟，精密加入预热至370.5 的牛血红蛋白试液5ml ，摇匀，并准确计时，在370.5 水浴中反应10分钟。立即精密加入5% 三氯醋酸溶液5ml ，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。另取试管2 支，各精密 加入血红蛋白试液5ml ，置370.5 水浴中保温10分钟，再精密加入 5三氯醋酸溶 液5ml ，其中1 支加供试品溶液1ml ，另1 支加对照样品盐酸溶液1ml ，摇匀，过滤，弃初滤液，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，按照分光光度法在275nm 的波长处测定吸收度，算出平均值S 和，按下式计算。 每g含蛋白酶活力单位数s10181.19式中：S 为对照品的平均吸收度；为供试品