甲基亚砷酸对内皮型一氧化氮合酶磷酸化影响

1、甲基亚砷酸对内皮型一氧化氮合酶磷酸化影响【关键词】甲基亚砷酸(a)；砷中毒；ens磷酸化；活性氧自由基(rs)摘要：目的观察无机砷的活性中间产物甲基亚砷酸(a)对牛主动脉血管内皮细胞(bae)的内皮型一氧化氮合酶(ens)磷酸化以及活性氧自由基(rs)产生的影响。方法培养的bae分别暴露于a(075l/l，015in)；亚砷酸钠(ias，100ll，060in)；或n乙酰半胱氨酸na，1ll)预处理2h后，再暴露于a(075ll，015in。收获细胞悬液进展ens磷酸化蛋白的esternblt分析；应用二氯二乙酰荧光素法(h2dfda)观测细胞内的rs产生。结果bae暴露于a(075ll)15

2、in后，ensser1179磷酸化显著增加p005)，na预处理(1ll)可以抑制这一现象；ias暴露也可以诱导ensser1179磷酸化p005)，但是需要高浓度和更长的暴露时间(100ll，30in)；a(075ll)暴露可以诱导bae产生rs，na预处理(1ll)可以抑制这一现象。结论a暴露可以诱导细胞内产生rs以及rs依赖性ens磷酸化。关键词：甲基亚砷酸(a)；砷中毒；ens磷酸化；活性氧自由基(rs)studynensphsphrylatininduedbynethylarsnusaidlibing,angyi,sunguifan.departentfupatinalhealth,

3、shlfpublihealth,hinaedialuniversity(shenyang110001,hina)abstrat：bjetivetbservetheeffetsfnethylarsnusaid(a)nensphsphrylatinandreativexygenspeies(rs)generatininbvineartiendthelialells(bae).ethdsulturedbaeasexpsedta(075l/l,015in)ithutrithaetylysteine(na)pretreatent(1l/l,2h),rias(100l/l,060in).esternblt

4、raellularrsgeneratinasassessediththefluresentprbe,2,7dihlrdihydrflureseindiaetate(h2dfda).resultsa(075l/l)ausedarapidinreaseinphsphrylatedensser1179at15inafterexpsure(p005).inntrast,upt100l/liasausedtheinreasefphsphrylatedensser1179at30in(p005).astiulat

5、edthersprdutininliveells.bththeainduedensser1179phsphrylatinandrsgeneratinereblkedbynapretreatent(1l/l,2h).nlusinaexpsureaninduersgeneratinandrsdependentensphsphrylatin.keyrds：nethylarsnusaid(a);arsenipisn;ensphsphrylatin;reativexygenspeies(rs)无机砷的体内代谢中间产物甲基亚砷酸(a)比无机砷的细胞毒性和遗传毒性更强1，因此其毒性效应是砷中毒发病机制研究的

6、一个新热点。研究说明，无机砷可以激活人类角质细胞和白血病jurkat细胞的内皮型一氧化氮合酶(ens)磷酸化2，3，还可以诱导产生h22和超氧阴离子自由基(-2)等活性氧自由基(rs)4。本研究观察a对牛主动脉血管内皮细胞(bae)的ens磷酸化以及rs产生的诱导作用。1材料与方法11主要试剂和仪器a(h3as，获赠自加拿大ullenr实验室)；亚砷酸钠(ias，ak)；n乙酰半胱氨酸(na，ak)；二氯二氢二乙酰荧光素(h2dfda，leularprbes)；2细胞培养箱(kendr)；电泳仪和转膜装置(att)；共聚焦荧光显微镜(leiairsystes)。12细胞培养bae培养于高糖培养

7、基def12)(siga)，添加成分包括10胎牛血清、10u/l青霉素和100g/l链霉素、10u/l肝素和5ng/l成纤维细胞生长因子。37，52常规培养。13ens磷酸化的esternblt分析暴露因素包括a(075l/l，015in)；ias(100ll，060in)；或na(1ll)预处理2h后，再暴露于a(075ll，015in)。参加细胞裂解液收获细胞悬液，低温离心后取上清冻存备用。十二烷基磺酸钠sds聚丙烯酰胺凝胶后进展蛋白印迹esternblt分析。特异性一次抗体为抗phsphensser1179抗体和抗ens抗体(分别1：1000稀释)；特异性二次抗体为hrp标记的抗兔或抗小

8、鼠二次抗体。自显影胶片扫描后用adbephtshp701软件处理输出，并进展定量分析。共进展独立实验3次。14细胞内rs产生的荧光测定应用荧光染料h2dfda。详细实验步骤为：80交融的bae细胞参加5llh2dfda孵育20in后暴露a(075ll，015in)；或na(1ll)预处理2h的最后20in参加h2dfda共同孵育，然后暴露于a(075ll，015in)。用倒置荧光显微镜观测细胞内的rs产生。激发光和发射光波长分别为480和527n。共进展独立实验3次。15统计分析应用spss100统计软件进展单因素方差分析和q检验。2结果21a或ias暴露对ensser1179磷酸化的影响ba

9、e暴露于075lla15in后，ensser1179磷酸化显著增加p005)，为对照组的141倍(图1)。而一样实验条件下，100llias暴露30in才可诱导ensser1179磷酸化p005)，为对照组的132倍(图2)。各实验组的细胞内总ens蛋白含量没有变化。a：esternblt的典型结果图1a暴露对ensser1179磷酸化的诱导作用略a：esternblt的典型结果图2ias暴露对ensser1179磷酸化的诱导作用略22a暴露诱导rs依赖性ensser1179磷酸化和细胞内rs产生na预处理(1ll)抑制a(075nll)暴露诱导的ensser1179磷酸(图3)。df荧光检测

10、法说明，a(075ll)暴露确实可以诱导bae产生蓝绿色荧光，提示有rs的生成，并且na预处理(1ll)后，蓝绿色荧光显著减弱，提示rs生成可以被抑制。图3na预处理抑制a暴露诱导的ensser1179磷酸化略3讨论ser1179是ens分子2个最重要的磷酸化位点之一。研究说明，ser1179磷酸化通过在ser1179基团增加一个负电荷而增加ens复原酶区域的电子流动、以及降低钙调蛋白ens复合物解离这两个方面，引起ens活化5。ens磷酸化对于机体的ens活化具有重要作用。本研究发现，075lla暴露15in后，ensser1179磷酸化显著增加，提示a暴露初期可能诱导体内的ens活化。ia

11、s暴露也可以诱导ensser1179磷酸化，但是需要高浓度和更长的暴露时间，提示ias的细胞效应可能是通过其代谢中间产物a间接作用的结果。本研究中，a诱导产生的ensser1179磷酸化可以被抗氧化剂na有效抑制，提示内皮细胞产生的rs可能在其中发挥作用。进一步应用df荧光检测观测到a(075ll)暴露产生的荧光，并且这种荧光也可以被na预处理所抑制，提示a暴露激活ensser1179磷酸化具有rs依赖性。本研究说明，a暴露可以诱导细胞内产生rs以及rs依赖性ens磷酸化。(本研究得到中日川医学研究者制度的支持和日本筑波大学熊谷嘉人教授的指导，在此一并表示感谢)参考文献1vaskenapshi

12、anh,zakharyanra,avrad,etal.arevieftheenzylgyfarsenietablisandaneptentialrlefhydrgenperxideinthedetxiatinfthetrivalentarsenispeiesj.txilapplpharal,2022,198:327-335.2suzak,addkda,zhangq,etal.arseniteativatinfp13k/aktellsurvivalpathayisediatedbyp38inulturedhuankeratinytesj.led,2001,7:767-772.3hssaink,akhandaa,kaaty,etal.aspaseativatinisaeleratedbytheinhibitinfarseniteindued,ebraneraftsdependentaktativatinj.freeradibiled,2022,34:598-606.4kuagaiy,pij.leularbasisfrarseniinduedalteratininnitrixideprdutinandxidativestress:ipliatinfendtheli