用于再灌注损伤研究的两种肝移植模型的筛选

1、用于再灌注损伤研究的两种肝移植模型的挑选【摘要】目的：挑选一种用于研究肝移植过程中缺血再灌注损伤的大鼠肝移植模型。方法：将SD大鼠随机分为假手术组(S组)、原位肝移植组(LT组)与自体肝移植组(AT组)。比较各组大鼠手术时间、存活率及术后24h血清中总胆红素(TB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及血清肿瘤坏死因子-(TNF-)含量，观察肝组织形态学改变。结果：与S组相比LT组、AT组术后血清TB、ALT、AST升高明显，AT组较LT组术后存活率明显进步，血清TB、ALT、AST及TNF-含量明显降低，肝形态异常变化减轻(P0.05)。结论：自体肝移植模型手术简单、成功率高、可比性

2、强，且排除了免疫损伤的影响，更好地反映了肝脏缺血再灌注损伤的病理生理过程，比较适宜作为肝移植缺血再灌注损伤研究的动物模型。【关键词】肝移植再灌注损伤大鼠【ABSTRAT】bjetive:Tseletaresuitablelivertransplantatindelfrstudyingisheireperfusininjury.ethds:SDratsererandlydividedintthreegrups:shaperatingrup(S),rthtpilivertransplantatingrup(LT)andanalgilivertransplantatingrup(AT).Thereq

3、uireentfrir-surgialskills,survivalrateanddeteriratinfhistrphlgyafterperatinangeahgruperebserved.Atthesaetie,thelevelsfttalbilirubin(TB),alanineaintransferase(ALT),glutaixalaetitransainase(AST)andturnersisfatr-(TNF-)intheseruat24hursafterperatinerererded.Results:ThelevelsfTB,ALT,ASTandTNF-inATgrupand

4、LTgruperehigherthanthseinSgrup.InATgrupthepathlgialhangesereilderandthelevelsfTB,ALT,AST,TNF-erelerinATgrup(P0.05)paringithLT,andATgruprequiredir-surgialskillsandhadhighersurvivalrate(P0.05).nlusins:ATsiplifiesthepredurefLT.Itreallyrefletsthepathphysilgiursefisheireperfusininjury,therefreitanbehsena

5、sanidealdelfrstudyingisheireperfusininjuryinlivertransplantatin.【KEYRDS】LivertransplantatinReperfusininjuryReperfusin缺血再灌注损伤存在于任何术式肝移植手术过程中，是造成移植肝无功能的重要原因之一。为了研究肝移植过程中缺血再灌注损伤，大多采用Kaada等1-2提出的“双袖套法创立大鼠肝移植模型。此模型手术操作难度大，存活率低且不能排除免疫排斥因素对术后供肝的影响。因此，选择一种研究缺血再灌注损伤适宜的肝移植模型很有必要。1材料与方法1.1试验动物清洁级SD大鼠，雌雄不限，鼠龄81

6、0周，质量250300g(平均280g)。江苏省实验动物中心提供，容许证号：SYXK(苏)2002-0045。1.2主要材料与仪器酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(北京晶美生物工程)，阿托品注射液、乙醚(上海第一生化药业)，注射用低分子量肝素钠(江苏万邦生化医药股份)。JE-2000EX型透射电镜(日本，lypus)，P10SP型光学显微镜(日本，lypus)，iVnt显微图象分析系统(上海，光学仪器厂)，SP-2102UV型紫外可见分光光度计(上海，光谱仪器)，FA1004N型电子天平(上海，精细仪器仪表)，动物实验手术台及显微外科手术器械购于上海医疗器械手术器械厂。1.3实验方法光

7、学显微镜观察：每只随机摄取6个400倍视野;电子显微镜观察：每只随机摄取6个23000倍视野。用iVnt图象分析系统定量分析肝细胞核平均面积、线粒体光密度。各标本数值取6张图像的均数。2结果2.1手术时间、成功率及术后存活率LT手术87只，成功50只(成功标准为术后大鼠能立即翻身、觅食)，手术成功率57.5%，术后24h存活37只，术后15d存活21只，存活率分别为74.0%，50.0%。AT手术54只，成功50只，手术成功率92.6%，术后24h存活46只，术后15d存活36只，存活率分别为92.0%，85.7%，与LT组相比差异有统计学意义(P0.05)。手术时间见表1。2.2血清TB、A

8、LT及AST含量的变化LT组及AT组术后24hTB、ALT、AST较S组明显增高(P0.05)，AT组较LT组低(P0.05，见表2)。2.3血清TNF-含量术后24hAT组与LT组，血清中TNF-含量均较S组(9.10.8)pg/L高(P0.05)，AT组为(23.31.2)pg/L，明显低于LT组(63.27.4)pg/L(P0.05)。2.4形态学改变LT组术后24h病理切片，肝细胞水肿明显，大量炎细胞浸润，局部区域出现大片状坏死(图1);AT组肝组织水肿程度较LT组轻，组织间可见炎细胞浸润，偶见点状变性、坏死(图2)。电镜下AT组与LT组细胞核及线粒体肿胀程度较S组重(P0.05)，L

9、T组细胞核面积较AT组大，线粒体光密度较AT组小(P0.05，表3)。细胞核面积越大、线粒体光密度越小提示细胞水肿越明显4。3讨论本研究LT与AT两种肝移植模型，AT手术难度小，显微外科技术要求较LT低，一般经50例左右训练均可到达90%以上的手术成功率。此外，AT可准确控制无肝期和肝脏冷缺血时间，模型建立比较稳定，节约试验材料，解决了LT肝动脉吻合困难的问题。本研究中LT组术后肝功能、血清TNF-程度及细胞形态学检测均提示其炎症损伤较AT组重。对于LT组，很难指出这些损伤主要是免疫排斥、缺血再灌注还是手术操作引起。影响LT组术后各项检测指标的因素多，而且关系复杂。相比之下，AT简化了多种损伤

10、因素，更适宜用于肝移植过程中缺血再灌注损伤的研究。但造模过程中仍需注意以下几个方面：1)麻醉：乙醚易刺激呼吸道，引起呼吸道分泌物过多而窒息或术后并发肺部感染。术前10in阿托品肌肉注射，可减轻乙醚刺激引起的呼吸道分泌。大鼠无肝期，血液循环受到严重影响，麻醉药物代谢减慢，此时应相应减轻麻醉深度，但仍要保持有效麻醉，以免大鼠清醒欲起身挣扎，严重影响以后的手术操作。术中麻醉的深浅可根据大鼠的呼吸状态和肝脏的颜色来判断麻醉深浅，调节用量5-6。2)出血：出血是大鼠术中和术后24h内死亡的主要原因，其中几处隐蔽血管的处理不当易致出血。食管与肝的韧带间有一较粗血管，如不注意处理，往往导致出血。结扎右肾上腺

11、静脉操作较困难，需要剪开肝下下腔静脉与右肾上腺之间的疏松组织，才能较清楚地暴露右肾腺上静脉。肝上下腔静脉前方的膈肌回流静脉血管多且变异较大，多无法结扎，夹闭肝上下腔静脉时，应靠近肝上缘嵌夹，防止遗漏膈肌汇入腔静脉的血管而造成失血。肝动脉较脆，加之大鼠全身肝素化后凝血功能较差，血管夹钳夹肝动脉易造成术后出血，因此对不做胆管研究的肝移植模型7，直接结扎肝动脉较为稳妥。3)肝脏灌洗：AT术中肝脏灌洗不同于LT，本研究在LT术中对供体肝脏经腹主动脉行冷灌注，一方面减轻对门静脉的机械性灌注损伤;同时灌注液既可直接经肝动脉灌洗肝脏，又可经腹部各器官循环后进入门静脉灌注肝脏，使肝脏得到双重灌注，灌洗更均匀、更彻底后。AT大鼠，为保证大鼠存活，无法施行由腹主动脉灌注，只能经门静脉灌肝。为保证获得良好的灌注效果，首先，注意游离肝脏的手术操作要轻柔，防止损伤肝脏局部造成微血栓，影响灌肝;其次，在阻断肝脏血流后要迅速插入灌注针进展灌肝，因为大鼠血液高凝，易形成血栓;再次，肝脏灌注时，压力恒定，低压灌注，防止冲坏血窦8，可用棉签轻柔的挤压肝脏，促使