气阴双补法对干燥综合征小鼠的实验研究

1、气阴双补法对枯燥综合征小鼠的实验研究【摘要】目的研究气阴双补法对枯燥综合征小鼠的作用。方法将60只Bab/小鼠，按体质量随机分为6组，每组10只，即正常组，模型组，羟氯喹组，增液布津汤小剂量组、中剂量组和大剂量组。对照组用羟氯喹片剂，观察体质量、摄食量、饮水量、唾液流量、脾指数及颌下腺病理形态学变化。结果增液布津汤能有效缓解口干、口腔烧灼感、眼干、眼异物感、鼻干等临床病症。实验室检查方面能增加唾液流量及泪流量，病理显示能抑制淋巴细胞浸润。结论运用气阴双补不仅能缓解枯燥综合征小鼠临床病症，而且能纠正免疫紊乱,疗效优于对照组。【关键词】气阴双补；枯燥综合征；小鼠Abstrat：bjetiveTre

2、searhthefuntinftheethdfnurishingbthqiandbldntheiehavingSS.ethdsPutthe60Bab/ieint6grupsardingtthEirEIghtatrand,thereere10ieineahgrup.Thegrupsinludedthenralgrup,thedelgrup,thehydrxyhlrquinegrup,thel,iddleandhighdsegrupusingZengyeBujinDetin.eusedhydrxyhlrquinetabletsntheieinthentrlgrupandthenbservedthe

3、indexeight,fdintake,aterintake,salivaryflrate,spleenindexandthepathrphlgybservatinfsubandibulargland.ResultsZengyeBujinDetinuldeffetivelyrelievedryuth,burninguthsensatin,dryeye,eyefreignbdysensatin,drynseandsetherlinialsypts.Theexainatinflabshedituldinreasesalivaryflrateandtearflrate.Pathlgyalsshedi

4、tuldrestraintheinfiltratinflyphyte.nlusinTheuseftheethdfnurishingbthqiandbldanntnlyrelievethelinialsyptsftheiehavingSS,butalsrretiunlgiderangeent,hseeffiayisbetterthanthseinthentrlgrup.Keyrds：Nurishingbthqiandbld；SS；ie；Experientalresearh枯燥综合征(Sjgrenssyndre，SS)是一种进犯外分泌腺体尤以唾液腺和泪腺为主的慢性自身免疫玻本病病因可能与遗传、免疫

5、、性激素、内分泌和病毒感染等因素有关。中医学无此病名，根据其发病及临床特征，将之归属祖国医学“燥证“燥痹范畴。金元时期，刘河间在?素问玄机原病式燥类?中指出：“诸涩枯涸，干那么皴揭，皆属于燥；并创立麦门冬饮子以治之。明清以后，各家对燥证已阐述颇多，均从不同角度对燥证进展了较系统的讨论和研究。最具代表性的是清代喻嘉言，认为除燥伤于外皮肤皴揭之外，燥伤于内而致的精血枯涸亦属于燥证范畴，并根据刘河间“风热胜湿为燥的理论提出了辛凉甘润法治疗燥证，代表方剂为著名的清燥救肺汤。然而，从临床研究发现，SS除与阴虚燥毒有关外，与气虚因素亲密相关，运用气阴双补法对枯燥综合征小鼠实验研究，通过研究其对小鼠的干预作

6、用，旨在为临床治疗提供确切根据。1材料与仪器1.1动物12周龄Bab/小鼠，60只，1822g，雌性，由南京青龙山实验动物中心提供。1.2药品增液布津汤，由南京中医药大学药学院制剂研究室提供；硫酸羟氯喹hydrxyhlrquine，HQ，上海中西制药，批号：040501。2方法2.1分组及给药60只Bab/小鼠，按体重随机分为6组，每组10只。临用前分别将上述药物用生理盐水配成以下浓度：正常组：生理盐水10l/kg；模型组：生理盐水10l/kg；羟氯喹组：0.1g/kg；增液布津汤小剂量组：0.05g/kg；增液布津汤中剂量组：0.075g/kg；增液布津汤大剂量组：0.10g/kg。且小鼠灌

7、胃体积为10l/kg。各组均在第0天即开场给药。2.2抗原的制备取8只Bab/小鼠，脱颈椎处死，75%酒精浸泡10in，在无菌操作台上解剖颈部，取出两侧颌下腺，别离包膜及结缔组织，用氯化钠注射液洗净，置无菌滤纸上吸干，称重，用显微剪剪碎，每0.1g置入10l无菌试管中，加氯化钠注射液2l，在冰浴中用匀浆器以5000r/in匀浆20s，4低温离心机中3000r/in离心20in，弃去上层脂质，吸出上清液，置10l无菌试管中，以上操作均在低温下进展。2.3Lry法蛋白定量2.3.1溶液配制溶液A：0.5guS4H2、1g4H46KNa4H2加重蒸水至100l；溶液B：2gNa23、0.4gNaH加

8、重蒸水至100l；溶液：1l溶液A加50l溶液B，混匀；溶液D：10lFlin酚试剂加10l重蒸水混匀。2.3.2检测精细汲取样品溶液1l，参加5l溶液，混匀，在室温下放置10in，加0.5l溶液D，混匀，30in后以分光光度计测定吸光值，检测波长为650n。2.3.3标准曲线的制备分别精细汲取1.0l系列对照品溶液于具塞试管中，以1.0l蒸馏水作空白对照，Lry法测定，用752紫外可见分光光度计在650n波长处测定吸收度。以牛血清蛋白对照品浓度为横坐标，吸收度A为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算蛋白含量。2.4SS小鼠模型的制备用灭菌PBS将抗原稀释成800g/l，加等量弗氏完全佐剂

9、，使抗原变为400g/l的油水混合乳剂，第0天，模型组、羟氯喹组、大、中、小剂量组小鼠每侧腹股沟酒精消毒后注射0.05l，即每只小鼠注射0.1l抗原。第14天，用弗氏不完全佐剂将抗原调整为400g/l，小鼠每侧腹股沟酒精消毒后注射0.05l。正常组小鼠注射0.1lPBS加佐剂。在第2天及第7天，各只小鼠腹腔注射0.05l白百破结合疫苗。2.5检测指标2.5.1小鼠体质量、摄食量、饮水量的测定每2天称小鼠体质量，每2天加饲料100g，加水100l，2d后称量剩余饲料量及水量，投入的饲料量或水量分别减去剩余饲料量或剩余水量即为每2天每笼小鼠摄食量及饮水量。2.5.2小鼠唾液流量的测定每周测定每只小

10、鼠唾液流量，测定前禁食1h，不禁水。测定前做好棉球称干重，重量范围4.55.0g。测唾液分泌时将已经称好干重的棉球放入实验小鼠口颊内，5in后取出，电子天平上称湿重。唾液分泌量g湿重干重2.5.3脾指数、颌下腺指数的测定于实验完毕，小鼠眼眶取血后脱颈椎处死，取血，3000r/in离心10in，取血清用于细胞因子测定。取脾及颌下腺称重。脾指数脾重量g小鼠体重g1000颌下腺指数颌下腺重量g小鼠体重g10002.5.4小鼠外周血中T淋巴细胞亚群检测小鼠眼眶取血后脱颈椎处死，取血，流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群D3，D4，D8。转贴于论文联盟.ll.3结果3.1体质量正常组小鼠体质量稳定，缓慢增加，其

11、他组均在第1次免疫后68d开场体重出现减轻，与正常组有显著性差异，模型组体质量持续下降，给药组体质量亦持续下降，但给药后小鼠体质量维持在较稳定程度，羟氯喹、增液布津汤孝中、大剂量组分别在第24，20，16天与模型组比拟出现显著性差异。结果见表1。表1增液布津汤对SS小鼠体质量的影响(略)3.2摄食量正常组小鼠摄食量在实验期间维持稳定，而承受抗原注射的小鼠摄食量减少，从第6天起较为明显，而增液布津汤对小鼠摄食量无影响，与模型组比拟无差异。结果见表2。表2增液布津汤对SS小鼠摄食量的影响(略)3.3饮水量在实验初各组小鼠饮水量无差异，在承受抗原注射第12天后小鼠饮水量出现明显增加，模型组小鼠饮水量

12、持续上升直至实验末，而羟氯喹和中药能在一定程度上降低SS小鼠饮水量并维持在一定程度。结果见表3。表3增液布津汤对SS小鼠饮水量的影响(略)3.4唾液流量在实验适应期及免疫后第1周各组小鼠唾液流量无差异，从第2周起，模型组小鼠唾液流量与正常组比拟显著降低，并逐渐降低，而给予羟氯喹和中药后，能增加SS小鼠唾液流量，分别在第4，3，2周与模型组比拟有显著性差异。结果见表4。表4增液布津汤对SS小鼠唾液流量的影响(略)3.5脾重、脾指数模型组小鼠脾重、脾指数与正常组比拟均显著增加，而给予药物后，均能显著降低SS小鼠的脾重、脾指数。结果见表5。表5增液布津汤对SS小鼠脾重、脾指数的影响(略)3.6颌下腺

13、重、颌下腺指数模型组小鼠颌下腺重、颌下腺指数与正常组比拟均显著增加，而给予药物后，均能显著降低SS小鼠的颌下腺重、颌下腺指数。结果见表6。表6增液布津汤对SS小鼠颌下腺重、颌下腺指数的影响(略)3.7小鼠外周血中T淋巴细胞亚群的比拟小鼠外周血T淋巴细胞亚群的比拟，各组D3+D4+/D3+D8+值均在正常范围内，但模型组比值最低，西药组作用变化不明显，而中药组比值有一定进步，说明中药组对D3+D4+/D3+D8+有一定的调节作用。见表7。表7小鼠外周血T淋巴细胞亚群的比拟(略)4讨论运用气阴双补法治疗枯燥综合征小鼠，增液布津汤能明显改善小鼠口干、体重减轻情况，增加唾液流量、脾重、脾指数，颌下腺重

14、、颌下腺指数也明显增加，而中药对饮食量影响不大。对小鼠外周血T淋巴细胞亚群D3+D4+/D3+D8+有一定的调节作用。4.1组方分析增液布津汤由麦冬、黄芪、太子参、枸杞子、生地、赤白芍、桃仁、紫菀9味药物组成。方中重用麦冬为君药。古人云：“治火可用苦寒，治燥必用甘寒。麦冬味甘，性微寒。色兼黄白，能入胃以养胃液，入脾以助脾散精于肺，引肺气清肃下行，统调水道以归膀胱。升降濡润之中，兼具开通之力。达清热滋阴润燥之旨，防燥热阴伤之患。重用黄芪为君药。黄芪性味与归经：甘，微温，归肺、脾经，具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌成效。明?本草纲目?载：“耆长也，黄芪色黄，为补者之长故名。?本草汇言?载：“

15、黄芪，补肺健脾，卫实敛汗，驱风运毒之药也。?本草逢原?载：“黄芪能补五脏诸虚，治脉弦自汗，泻阴火，去肺热，无汗那么发，有汗那么止。本病肺脾之气俱虚，运用黄芪能达补肺健脾之效。太子参为臣药，性甘、微苦、平，归脾、肺经，具有补气健脾、生津润肺成效。能补脾肺之气，兼能养阴生津，其性略偏寒凉，属补气药中的清补之品。枸杞子为臣药，甘，平，归肝、肾经，滋补肝肾，益精明目。用于虚劳精亏，腰膝酸痛，眩晕耳鸣，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明。明代?药鉴?指出：枸杞子“滋阴，不致阴衰。生地黄味甘、苦，性寒，归心、肝、肺经，既能凉血，又能滋阴，具清热滋阴、凉血止血、生津止渴的成效。在?神农本草经?记载生地黄能“逐血痹

16、“除寒热积聚“除痹，?珍珠囊?中记载：“生地黄凉血，生血，补肾水真阴，“为清热凉血养阴生津之要药。因此，生地黄为臣药，与麦冬二药合用，金水相生，畅利三焦。赤芍药酸苦性平，有散邪行血之功，?别录?言：“通顺血脉，缓中，散恶血，逐贼血。白芍药酸苦，性平，有敛阴益营之力，“收阴气而泄邪气“敛津液而益荣一泻一补，有相辅相成之效。白芍药敛阴、赤芍药凉血，合用敛阴凉血而不恋邪。桃仁味苦甘，性平，入心、肝、大肠经。具有破血行瘀，润燥滑肠的成效。?本草纲目?记载桃仁主血滞风痹，?用药心法?曰“桃仁，苦以泄滞血，甘以生新血，故凝血须用。又去血中之热。李杲用桃仁治疗“热入血室，腹中滞血，皮肤血热燥痒，皮肤凝聚之血

17、。紫菀虽苦辛而温，但柔润有余，非燥烈可比。专能开泄肺郁，宣通窒滞，兼疏肺家气血，达宣开肺气，输布津液之效，以助药力，引诸药直达病所。以上4药共为佐使。诸药合用，共奏清燥解毒、活血化瘀、输布津液之成效。4.2作用机制探析增液布津汤的组成药物大多数具有调节免疫的作用。现代药理证明，麦冬含多种沿阶草甾体皂苷、谷甾醇、氨基酸、多量葡萄糖及其葡萄糖苷等。具多种药理作用。其中对免疫系统的调节主要表达在麦冬多糖及皂苷上。国内外大量的研究说明，多糖对体液免疫、细胞免疫功能的促进和诱生多种细胞因子，是多糖发挥药效作用的机制之一1，2。麦冬多糖能显著增加小鼠脾重量、增强小鼠碳粒廓清作用、刺激小鼠血清中溶血素的产生

18、3，可显著对抗环磷酰胺引起的小鼠白细胞下降，并能抑制淋巴细胞粘附于细胞外基质，改善由淋巴细胞浸润所致肝功能损伤。同时短葶山麦冬皂苷能极显著的增加小鼠免疫器官胸腺、脾脏的重量，可显著增加小鼠的碳粒廓清作用4。黄芪能增强网状内皮系统的吞噬功能，使血白细胞及多核白细胞数量显著增加，使巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数显著上升，对体液免疫、细胞免疫均有促进作用。太子参含氨基酸、多糖、皂苷、黄酮、鞣质、香豆素、甾醇、三萜及多种微量元素等。太子参总皂苷对小鼠抗疲劳、耐缺氧、耐低温有明显的作用。太子参总皂苷能增加小鼠免疫器官的重量，对小鼠网状内皮系统(RES)吞噬功能有明显的激活作用，对小鼠免疫后血清中溶血素的生成有一定的促进趋势。太子参对淋巴细胞有明显的刺激作用。枸杞子有增强非特异性免疫作用，对白细胞介素也有双向调解作用。小鼠灌服枸杞子水提取物或肌注醇提取物和枸杞多糖，均有进步巨噬细胞的吞噬功能，增强血清溶菌酶的作用，进步血清中抗绵羊红细胞抗体的效价，还能增加鼠脾脏中抗绵羊红细胞的抗体形成细胞的数量。从枸杞子提取的枸杞多糖可见到对动物有放射增敏现象，可保护小鼠免受因放射损伤引起的免疫功能低下，对下降的白血球有提升效果。赤芍有抗血栓形成、抗血小板聚集、抗凝血、激活纤溶作用，与其清热凉血成效有关；其还有保肝、镇痛、镇静、解痉等作用，与其散瘀止痛成效有关。研究说明赤