β细辛醚对谷氨酸所致PC12细胞损伤的爱惜作用

1、- 细辛醚对谷氨酸所致 PC12细胞损伤的爱惜作用陈奕芝 , 方永奇 , 梁 毅, 王绮雯 , 何玉萍【摘要】 目的 研究 - 细辛醚对谷氨酸所诱导的 PC12细胞损伤的爱惜作用 , 并探讨其作用机理。方式 用谷氨酸造成 PC12细胞损伤模型, 观看 - 细辛醚对其细胞形态、损伤程度、存活力、钙离子浓度和细胞凋亡的阻碍。结果 10 mmol/L 谷氨酸作用 PC12细胞 16 h, 显现明显损伤 , 凋亡率和死亡率升高 , 培育上清液中 LDH含量增加；、1 五、30g/mL- 细辛醚可有效改善谷氨酸损伤引发的 PC12 细胞形态改变 , 提高细胞存活力 , 减少乳酸脱氢酶渗漏； 1 五、30

2、 g/mL - 细辛醚能明显降低谷氨酸引发的 PC12 细胞内钙离子浓度和细胞凋亡率。结论- 细辛醚对谷氨酸所致 PC12 细胞损伤具有爱惜作用 , 其作用机制可能与钙拮抗作用有关。【关键词】 PC12 细胞；谷氨酸；钙； - 细辛醚Abstract ：ObjectiveTo study the protectiveeffectsof-asarone on PC12cellsdamageinduced by Glutamate.Method Theeffectsof -asaroneonPC12cellsafterGlutamateintoxication on morphology, ext

3、ent of damage, livability, intracellular calcium concentration and apoptosis ratio wereobserved.ResultMorphologicalchanges,LDH leakageandintracellular calcium concentration increasing, and cell survival decreasing were observed in PC12 cells exposured toGlutamate., 15, 30g/mL-asaronecan increasecell

4、survival,decrease LDH leakage. intracellular calcium15,30 g/mLconcentration -asarone can and apoptosisreduceratio.Conclusion -asarone prevents the toxicity of Glutamate, and it maybe attribute to its effect of anticalcium.Key words ：PC12 cells ；Glutamate ；Ca2+； -asarone本实验采纳体外培育PC12 细胞方式 , 用谷氨酸 (Glu

5、) 造成损伤模型 , 观看 - 细辛醚对PC12 细胞形态学、细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞内游离钙和细胞凋亡率的阻碍。实验材料细胞、药物和试剂高分化 PC12细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。Glu为 Amresco 产品；高糖 DMEM粉剂培育基、胎牛血清、马血清、 %胰酶均为 GIBCO产品；噻唑蓝 (MTT)为 Sigma公司产品；磷酸缓冲液 (PBS)、二甲基亚砜 (DMSO)为北京鼎国产品； Annexin v-FITC 试剂盒购自晶美生物工程； Fluo-3/AM 为 Biotium Inc 产品；LDH试剂盒购自南京建成生物工程研究所； 细胞培育板为 CORNIN

6、G产品。- 细辛醚的制备由本中心完成 , 纯度 %。临用前称取适量 - 细辛醚与吐温 -80 及甘油 , 以 111 充分混匀后加灭菌双蒸水配成终浓度为10 mg/mL- 细辛醚溶液 ,历时培育基稀释至所需终浓度。要紧仪器设备CO2 培育箱 (NUAIK)；倒置相差显微镜 (OLYMPUS)； BIO-RAD550型酶标仪； ALTRAEPICS流式细胞仪 (BECKMANCOULTER)；6010 紫外可见分光光度计 ( 惠普上海分析仪器 ) 。实验方式造模苏醒后的 PC12细胞接种于 25 cm2 培育瓶中 , 培育液为含 5% 马血清、 5%胎牛血清的 DMEM高糖培育基 ,37 、 5

7、% C02培育箱中培育。待细胞长满单层 ,%胰酶消化 , 用含血清的 DMEM培育基终止消化并调细胞密度为 5104 个/mL, 接种在 96 孔培育板 ( 弃去周围边孔 ), 每孔 100 L, 周围边孔每孔加入等体积 PBS溶液 , 待细胞贴壁生长交叉成网后用于实验。实验分为正常对照组、 Glu mmol/L) 损伤组 , 继续培育 16 h 后观看细胞形态改变 , 并用 MTT法检测细胞活力。药物爱惜实验PC12细胞接种于 96 孔( 每孔 100 L) 及 24 孔培育板 ( 每孔 1 mL), 培育条件同上 , 待细胞铺满单层 , 吸弃原培育基 , 用 PBS液洗 1 次,随机分为

8、6 组。正常对照组和 Glu 损伤组加入无血清培育基 , 阳性对照组加入终浓度为 10 mol/L 尼莫地平 , - 细辛醚设 3 个剂量组 , 别离为、 1 五、30 g/mL, 培育 4 h 后, 除正常对照组外 , 其余各组荡洗后加入终浓度为 10 mmol/L 的 Glu 继续培育 16 h, 用于各指标检测。观看指标细胞形态学观看、存活力(MTT 法) 、培育上清液LDH活性 ( 比色法) 、凋亡率和胞内钙离子浓度 ( 流式细胞仪荧光染色法 ) 。统计学方式数据以 xs 表示 , 采纳 SPSS 软件包分析 , 组间比较采纳单因素方差分析。3 结果谷氨酸对 PC12细胞的损伤作用PC

9、12细胞培育 2 h 后完全贴壁 , 呈神经细胞样形态 , 圆形 , 折光性较强 , 生长速度快 ,2 d后生长成网状。 PC12细胞经不同浓度Glu作用 16 h 后, mmol/L Glu 对 PC12细胞形态学和细胞活力没有明显转变 , 而 mmol/L Glu 那么对 PC12细胞有不同程度的损伤 , 表现为细胞变圆、皱缩 , 部份贴壁不良、脱落 , 裂解成碎片 , 折光度下降 , 细胞活力也明显下降 , 且呈剂量依托关系 , 故本实验选用 10 mmol/L Glu 为造模浓度 ( 见表 1) 。尼莫地平及 - 细辛醚预孵育 4 h, 其细胞形态无明显转变。表 1 不同浓度 Glu

10、对 PC12细胞活力的阻碍 ( 略) 注：与正常对照组比较 ,*P 。- 细辛醚对造模 PC12细胞活力、谷氨酸的阻碍( 见表 2) 表 2 - 细辛醚对造模 PC12细胞活力和 LDH的阻碍（略）注：与正常对照组比较 ,*P ,*P ；与 Glu 组比较 ,P, P( 下同 ) 。- 细辛醚对造模 PC12细胞凋亡率、胞浆游离钙的阻碍( 见表 3) 表 3 - 细辛醚对造模 PC12细胞凋亡和细胞内钙离子浓度的阻碍 ( 略)讨论PC12 细胞株来源于大鼠的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞, 生长迅速、稳固 , 不易发生自动转化 , 可成立能传代的二倍体细胞系 1 。其细胞形态、结构和功能皆类似于神经细胞

11、 , 成为最近几年来研究神经细胞递质合成、贮存和释放、离子通道规律及受体的细胞模型 2 。Glu 是一种中枢兴奋性氨基酸递质, 过量的 Glu 可促使突触前过量的蛋白激酶C(PKC)向细胞膜转移并活化 , 从而过度激活突触后膜的 Glu 受体 NMDA受体 , 促使 Ca2+内流。细胞内 Ca2+浓度上升又可激活细胞内的硫蛋白酶 (calpin-I), 引发细胞内骨架蛋白 -fordrin 降解, 使膜上 Glu 结合位点数量明显增加 , 致使胞内 Ca2+超载 , 显现迟发性损害 3 。本实验用 Glu 造成 PC12细胞损伤 , 通过观看和检测细胞形态学、细胞存活力、 LDH 释放量和细胞

12、凋亡和细胞内钙离子浓度的转变, 探讨 - 细辛醚对 PC12细胞 Glu 损伤的爱惜作用及其作用机理。本研究结果说明 ,PC12 细胞受到 Glu 损伤后 , 细胞存活率降低、 LDH 漏出率升高、细胞凋亡率和死亡率升高、细胞内钙离子浓度升高；- 细辛醚能提高细胞存活率、 降低 LDH漏出率、抑制细胞凋亡和死亡、降低细胞内钙离子浓度。 - 细辛醚与 PC12细胞预温育 4 h, 可选择性降低 Glu 引发的细胞内游离 Ca2+浓度的异样升高 , 抑制细胞凋亡 , 这可能是 - 细辛醚能特异性且剂量依托性地抑制 Glu 与其受体相结合 , 从而抑制受体门控钙通道的开放 , 减少胞外游离钙进入细胞内 , 减轻 Glu 的兴奋性毒性有关 , 从分子水平上初步说明了 - 细辛醚对兴奋性神经毒的爱惜作用机制。兴奋性氨基酸对神经细胞的损伤作用老是伴随着钙超载现象 , 笔者以为 , - 细辛醚对 Glu 引发的 PC12细胞损伤的爱惜作用可能与其钙拮抗作用有关。【参考文献】张均田 , 张庆柱 . 神经药理学研究技术与方式 M. 第 2 版. 北京：人民卫生出版社 ,.Shafter TJ, Atchison WD. Transmitter, ion channelandreceptorpropertiesofPC12cells： amodelforneurotoxicologicals