生物竞赛材料 PCR引物设计的原则

1、生物竞赛材料PCR引物设计的原则一、什么是引物引物是一段寡聚核苷酸序列引物的种类：PCR引物、测序引物、杂交探针、兼并引物、其他引物引物的作用（基因获得、测序、检测等）二、引物设计的一般流程1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。2、用Primer Premier5软件设计引物，设计时需考虑以下几个问题：（1）引物最好在模板cDNA的保守区内设计DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（A

2、lignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。（2）引物长度一般在1530碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。（3）引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好接近58-60GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）不要相差超过5 （4）引物3端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会

3、影响扩增的特异性与效率。（5）引物3端不能选择A。引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、 T之间，所以3端最好选择T。（6）碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似 性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。（7）引物自身及引物之间不应存

4、在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin） 使引物 本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 （8）引物5端和中间G值应该相对较高,而3端G值较低。G值是指DNA 双链形成所需的自

5、由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应当选用5端和中间G值相对较高，而3端G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的G值可以用Oligo 6软件进行分析）（9）引物的5端可以修饰,而3端不可修饰.引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 （10）扩增产物的单链不能形成二级结构.某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。3、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析