依托泊苷脂质纳米混悬剂及其冻干制剂的制备及体内外评价

1、依托泊苷脂质纳米混悬剂及其冻干制剂的制备及体内外评价淋巴瘤是一种严重威胁人类健康的疾病, 对于难治性或复发性患者, 高剂量化疗后自体干细胞移植是临床标准治疗方法。化疗药物依托泊苷( 简称 VP16或EPEG)被推荐为淋巴瘤高剂量化疗一线治疗药物。其作用机理为干扰 DNA拓扑异构酶 , 间接诱导 DNA断裂 , 从而阻滞肿瘤细胞于晚 S 期和 G2期。目前 VP16的上市制剂有软胶囊和注射液, 其中软胶囊剂口服每天 50 mg, 一天一次 ;VP16 注射液规格为 100mg(5mlL);500mg(25mL);1g(50 mL)三种。VP16上市制剂在临床应用中由于药物溶解性差、较严重的胃肠道

2、反应和剂量限制性毒副作用等问题导致淋巴瘤治疗高剂量给药难以实现。因此, 急需开发VP16新剂型解决上述问题。近年来 , 纳米药物的快速发展对肿瘤的治疗表现出巨大的应用潜力。脂质纳米混悬剂 (LNS)作为纳米给药系统中极具发展前景的一种剂型, 具有以下独特的优势 : 选用脂类材料作为稳定剂, 毒性低 , 生物相容性和安全性较好; 脂质纳米混悬剂的载药量较高 , 无药物泄露问题 , 从而可减小给药体积 , 尤其适用于VP16这种临床应用剂量大的难溶性药物; 处方中只含有适量的稳定剂, 避免了大量刺激性辅料的应用 , 可大大降低毒副作用 , 提高病人顺应性 ; 可利用纳米制剂的增强渗透与滞留效应(E

3、PR effect)增加药物在肿瘤部位的蓄积, 在增强抗肿瘤作用的同时降低药物对正常组织的毒副作用; 脂质纳米混悬剂的处方及工艺简单可行 , 更适合工业化大生产。本研究首次以大豆卵磷脂和聚乙二醇1000 维生素 E 琥珀酸酯 (TPGS)为稳定剂制备依托泊苷脂质纳米混悬剂(VP16-LNS)作为静脉注射用纳米制剂, 以期解决VP16上市制剂中药物溶解性差、临床给药剂量大导致注射体积大以及刺激性辅料的应用使患者顺应性差等问题, 在增强淋巴瘤治疗效果的同时降低毒副作用。本课题的主要研究内容与结果如下:1.VP16 含量测定方法的建立本课题采用HPLC法建立了 VP16 体外含量测定方法 , 对方法

4、的专属性、检测限与定量限、线性、日内日间精密度、方法回收率和加样回收率进行了考察。结果表明此方法专属性强,VP16 浓度在 25500 g/mL 范围内峰面积 A 与浓度 C 线性关系良好 , 精密度和回收率也均符合含量测定方法学的要求。因此,可以采用 HPLC法测定 VP16的含量。2.VP16-LNS的处方优化及体外性质评价本课题采用纳米沉淀法制备VP16-LNS,通过单因素考察和正交设计筛选最优处方与工艺条件, 以最优处方工艺制备三批 VP16-LNS并进行理化性质评价 , 主要包括制剂外观、 微观形态、粒径大小、 zeta 电位和载药量等。通过在VP16-LNS中加入 6%(w/v)

5、的甘露醇作为冻干保护剂制备 VP16-LNS冻干制剂 , 以进一步提高制剂的稳定性便于储存和运输。差示扫描量热法和X 射线衍射法考察冻干制剂的晶型结构。采用动态膜透析法考察 VP16-LNS在 pH 7.4 PBS( 含 1%吐温 -80,w/v) 中的释放行为。通过测定 VP16-LNS在不同介质中的粒径变化考察其稳定性。采用体外溶血实验考察 VP16-LNS的初步安全性以评价其是否适用于静脉注射给药。最后 , 以 Raji 人源淋巴瘤细胞及A20 鼠源淋巴瘤细胞为细胞模型, 采用 MTT法考察 VP16-LNS的体外细胞毒性。实验结果表明, 最优处方制备的VP16-LNS成球形或类球形颗粒

6、 , 粒径分布均匀 , 平均粒径为 (87.50 士 7.44)nm,PDI为0.224 0.039,zeta电位为 (-7.38 0.26)mV, 载药量为 (6.810.30)%。VP16-LNS冻干制剂呈均匀细腻疏松多孔的白色粉末且再分散性良好, 差示扫描量热法和 X 射线衍射法证明 VP16-LNS的冻干制剂以无定型或非晶型状态存在。体外释放结果表明VP16-LNS在前 5h 内 VP16累积释放量高达80%以上 , 随后缓慢释放。体外稳定性实验表明VP16-LNS在 pH 7.4 PBS, 细胞培养基 PRMI 1640 及血浆中的稳定性良好。 体外溶血实验结果显示VP16-LNS未

7、发生溶血现象 , 适宜静脉注射给药。MTT结果表明 VP16-injection和 VP16-LNS对两种淋巴瘤细胞具有明显的浓度依赖性细胞毒性。 此外 ,VP16-LNS 在 Raji 和 A20 两种淋巴瘤细胞上的IC50 值分别为 0.508g/mL 和 0.219 g/mL,VP16-injection的 IC50值分别为0.735 和 0.531,VP16-LNS 在 Raji 和 A20 两种淋巴瘤细胞上的IC5C 值显著低于VP 16-injection(p0.05)。3.VP16-LNS的体内性质评价以雌性昆明小鼠为动物模型, 采用 HPLC法考察VP 16-LNS 和 VP1

8、6-injection尾静脉注射后在小鼠体内的药代动力学特性, 并用DAS 2.0 软件处理药代动力学参数。采用近红外活体荧光成像技术, 选用亲脂性近红外荧光染料DiR 碘化物代替 VP 16 制备 DiR-LNS,观察小鼠尾静脉注射DiR-LNS后体内药物分布情况。以荷 A20 鼠源淋巴瘤的雌性BALB/c 小鼠为动物模型 , 评价 VP16-LNS的体内抗肿瘤活性。此外 , 本课题通过对不同处理组小鼠的体重变化、脏器系数、外周血象、肝肾指标、各器官组织病理切片、新西兰兔耳缘静脉刺激性等进行考察,评价 VP16-LNS的体内安全性。药动学研究结果表明 , 与 VP16-injection相比

9、 ,VP16-LNS可显著提高小鼠体内血浆中药物浓度 ,VP16-LNS给药组的药动学参数t1/2 、 AUC0-t、 AUMC0-t,和 MRTo-t 相比 VP16-injection 组分别提高到其 6.37 倍、 1.87 倍、 6.14 倍和3.00 倍 ,CL减小到VP 16-injection的 48%, 结果表明与VP16-injection相比 ,VP 16-LNS 可减慢VP16的体内清除速度并显著延长体内循环时间, 有利于增强抗肿瘤作用。体内近红外荧光成像结果表明,DiR-LNS 组小鼠相比游离DiR 组肿瘤部位显示出更强的荧光信号, 是游离 DiR 的 5.21 倍 , 提示 LNS可显著提高药物在肿瘤部位蓄积。体内药效学研究结果表明,VP16-LNS 组小鼠肿瘤体积显著小于VP16-injection组(p0.05),并且 VP16-LNS组的平均瘤重显著低于其他治疗组 ,VP16-LNS(25mg/kg) 组的肿瘤抑制率高达 93.68%(p0.01), 不同治疗组肿瘤组织 H&E、Ki-67 和 TUNEL染色结果也证明 VP16-LNS可显著增强淋巴瘤的治疗效果 (P0.05) 。小鼠体重变化、脏器系数、外周血象、肝肾指标、各器官组织病理观察、新西兰兔耳缘静脉刺激性的实验结果表明VP16-LNS相比VP16-injection具