小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨

1、小鼠肝Kupffer细胞别离方法讨论【摘要】目的讨论别离BALB/小鼠肝Kupffer细胞(K)的方法。方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法别离K，并比拟链霉蛋白酶、型胶原酶及联用链霉蛋白酶和型胶原酶等3种不同酶消化别离方法所得K得率及纯度。结果3种不同酶消化别离方法细胞得率分别为(6.320.5)106g-1，(3.660.4)106g-1，(10.30.7)106g-1；细胞纯度分别为(93.21.7)，(90.71.5)，(94.51.9)。结论结合链霉蛋白酶和型胶原酶在体灌注和离体消化是别离小鼠K的较好方法。【关键词】肝；枯否细胞；离心法,梯密度；小鼠，

2、近交BABL；细胞别离肝Kupffer细胞Kupfferell,K为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的8090。肝K能吞噬、杀灭病原微生物，去除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能1。近期发现K能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用2。如何获得较多数量和较高纯度的K是研究其在机体中作用机制的首要条件。而传统的别离方法往往因数量和纯度缺乏而影响实验结果。本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法别离K，讨论别离小鼠肝K的较好方法。1材料与方法1.1材料1.1.1实

3、验动物BABL/小鼠，雄性，1012周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供答应证号：046。试验前禁食12h，自由饮水，随机分为3组。1.1.3主要液体的配制1前灌注液Hanks平衡盐溶液。Kl5l/L,KH2P41l/L,Nal115l/L,HEPES25l/L。调整pH值为7.4。2后灌注液及酶消化液配制。后灌注液、酶消化液均由hanks平衡盐溶液配制。方法1中的后灌注液含0.20链霉蛋白酶2L；酶消化液：含0.20链霉蛋白酶2L、0.012DNAase2L；方法2中的后灌注液含0.025型胶原酶2L。酶消化液：含0.05IV型胶原酶2L；方法3中的后灌注液含0.05型胶原酶

4、1L、0.4链霉蛋白酶1L；酶消化液：含0.10型胶原酶1L、0.40链霉蛋白酶1L、0.012DNAase2L；1.1.4SPS液的配制100Perll液和8.5%NS以91的比例混合，配制成SPS原液；以70Perll液2L配制：SPS1.4L和PBS0.6L混合配制所得；30Perll液的配制：PBS1.4L和SPS0.6L混合配制所得。1.2BABL/小鼠K别离方法1.2.1原位肝脏灌注步骤参考文献3。1.2.2肝脏非本质细胞的提取及离心将上述肝细胞滤液4离心800r/in8in，取沉淀。参加PBS4L，4离心80r/in3in，除去沉淀，取上清。参加PBS4L充分混匀，再次以4离心1

5、50r/in8in，取沉淀。沉淀参加PBS2L,充分混匀。取10L离心管1支，依次参加70Perll、30Perll、细胞悬液各2L及少许PBS，4离心1600r/in22in。离心管自上而下依次为：细胞碎片、30Perll层、30Perll层与70Perll层之间的是大量K及少量肝窦内皮细胞、70Perll层、离心管底层为少许红细胞。取30Perll和70Perll层之间的白色物，PBS8L稀释细胞，4离心1次600r/in8in，4分别离心150r/in8in2次，除去上清。1.2.3K贴壁培养将上述细胞沉淀用适量10胎牛RPI1640稀释，取10L用台盼蓝染色检测细胞活性及细胞计数，分别

6、计算3种方法的K得率及纯度。于37、体积分数为0.05的2孵箱中培养。46h后更换培养液，去除非贴壁细胞，贴壁细胞即为试验所需的K。分别于1，24，48h下观察细胞形态及贴壁情况。1.3K的鉴定1.3.1荧光显微镜观察将K悬液滴于细胞玻片上，328n激发光，荧光显微镜下观察细胞自发荧光情况。1.3.2吞噬试验K分别培养6，24h后，参加50碳素墨水2L2h后，洗涤细胞以除去未吞噬的碳素颗粒，倒置显微镜下观察细胞吞噬情况。1.3.3免疫组织化学染色常规免疫组织化学染色，一抗为兔抗大鼠lyszye，每次试验均设置阴性对照组，以0.01l/LPBS代替一抗。1.4统计学处理计量数据以xs表示，采用S

7、PSS11.5统计软件分析。组间差异用单因素方差分析，以P0.05为差异有统计学意义。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1荧光显微镜观察在328n荧光激发下，未见K发出荧光。2.2K的形态变化新颖别离的K呈圆形，细胞核大，细胞质少，折光性较强，远小于肝细胞，接种1h后少局部细胞已贴壁；培养24h后，多数细胞已伸展；培养48h后，绝大多数细胞已贴壁，且充分伸展，可见星形或不规那么形；方法3所得K培养24h后的细胞贴壁及形态情况图1A。K:肝Kupffer细胞.A：K培养24h后的形态10；B：K培养6h后吞噬试验10；：K培养48h后免疫组织化学图像20.图1K培养24h后的形态、6h后的吞噬试验、48h后的免疫组织化学表现略Fig1rphusfKafter24hursulture,thephagytsistestfKafter6hursulture,iunhistheistryfKafter48hursulture2.33种方法别离的K活力、得率及纯度情况表1。表13种别离方法细胞得率及细胞纯度的比拟略Tab1parisntheyieldandpurityfKinthreeseparatinethdsn=10.与方法1比拟，：P0.05；与方法2比拟，#：P0.05；与方法1