植物总DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测课件

1、植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测植物基因组DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测植物基因组DNA的提取脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) 与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。背景知识核酸的存在形式脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) 背景知识核酸的存DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结

2、晶。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。 核酸的理化性质DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸基本过程细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸基本过程 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶，破坏细胞壁。 细胞破碎 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法；细胞破碎 SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, SDS能够破

3、坏这种价键。CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA提取SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。多糖 提取液中加1PVP。DNA纯化（去杂质）蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊实验材料 新鲜蔬菜叶片(去叶脉)试剂 2CTAB抽提液 TE 缓冲液(pH=

4、8.0) 氯仿：异戊醇(24:1) 材料与试剂实验材料材料与试剂离心机 水浴锅研钵 微量移液器仪器用具离心机 仪器用具移液器量程的选择移液器量程的选择1取 2g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加 1/3 药匙石英砂和 4mL 2 倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。2将 1mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中，置于65水浴中保温 20min，其间颠倒混匀23次。破碎细胞3. 12000r/min 离心 5min，取上清液700L转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀。12000r/min，离心 5min。抽提去蛋白4将上清液移入新的1.5mL离心管内，加 600

5、L异丙醇。颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸512000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。 将沉淀回溶于20L TE 缓冲液待测。操作步骤1取 2g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加 1/3 药匙石1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀；2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（25），尽可能选取幼嫩的材料；3）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。注意事项1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应

6、与 CTAB DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。电泳原理DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的仪器和试剂仪器电泳仪电泳槽灌胶模具等仪器和试剂仪器Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸

7、（TPE）常用电泳缓冲液 Tris-硼酸（TBE）常用电泳缓冲液 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用：增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。核酸染色剂注意事项：EB是

8、致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。溴化乙锭（EB）核酸染色剂注意事项：DNA分子量标准DNA分子量标准不同种类DNA Marker不同种类DNA Marker1.凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60 时，加入 EB 至终浓度 0.5g/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。2.加样 取10l DNA样液与 2l 上样 buffer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。4.观察拍照四、操作步骤1.凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 植物总DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测课件植物总DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测课件植物总DNA提取及琼脂糖凝胶电