真核细胞表达系统

1、之南宫帮珍创作自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到 生命科学研究的各个领域。 并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成， 越来越多的基因被发现， 其中多数基因 功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基 因功能及其相互作用的重要手段。在各种表达系统中，最早被采取进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆 入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒）转化细菌（通常选用的是 大肠杆菌），通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够

2、在较短时间内获得基因表达产品，而且所需的成底细对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点： 如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞发生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达， 导致产品纯化困难； 而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产品的生物活性较低。为克服上述缺乏，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控 领域，具优点是：根据原核生物蛋白与靶 DNA间作用的高度特异性设计，而靶 DNA 与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制；能诱导基因高效表达，可达 105倍，为

3、其他系统所不及；能严格调控基因表达， 即不但可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中经常使用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。1、酵母表达系统最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有HPolymorpha , Candida Bodini , Pichia Pastris3 种。以 Pichia Pastoris 应用最多。甲醇酵母的表达载体为整合型质粒

4、，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因一1(A0 x1),在该基因的启动子(PAXOI)作用下，外源基因得以表达。PAXOI是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOx1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAXOI可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达，将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可 以提高外源蛋白的表达水平及产量。此外甲醇酵母的表达载体都为E.coli /Pichia Pastoris的穿梭载体，其中含有 E.coli 复制起点和筛选标记，可在获得克隆后采取E.coli细胞大量

5、扩增.目前，将质粒载体转入酵母菌的方法主要有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达 产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。利用PAXOI表达外源蛋白时，一般需很长时间才干达到峰值水平， 而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使得实验操纵过程中存在不 小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。 因此那些不需要甲醇诱导 的启动子受到青睐包含 GAR FLD1、PEX8 YPTI等多种。利用三磷 酸甘油醛脱氢酶（GAP）启动子

6、代替 PAXOI不需要甲醇诱导。培养 过程中无需更换碳源， 操纵更为简便，可缩短外源蛋白到达峰值水 平的时间。酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应 用。2、昆虫细胞表达系统杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采取目宿银纹夜蛾杆状病毒 （AcNPV）作为表达载体。在 AcNPW 染昆虫细胞的后期，核多角体基因可编码发生多角体蛋白， 该蛋白 包裹病毒颗粒可形成包涵体。 核多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力，故常被用来构建杆状病毒传递质粒。克隆入外源基因的传递质粒与野生型 AcNPV共转染昆

7、虫细胞后可发生同源重组，重组后多角体基因被破坏，因而在感染细胞中不克不及形成包涵体，利用这一特点可挑选出含重组杆状病毒的昆虫细胞但效率比较低，且载体构建时间长，一般需要46周。止匕外，昆虫细胞不克不及表达带有完整N联聚糖的真核糖蛋白。在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表达引起昆虫细胞的裂解，胞质内的物质释放出来， 与目的蛋白混在一起， 从而使蛋白的纯化工作变得很困难，另外水解酶的释放会降解重组蛋白。为了克服以上这些困难，科学工作者先后测验考试用丝蛾肌动蛋白基因启动子或杆状病毒ie-1基因启动子表达外源蛋白，但效果都不明显。Farrel等介绍了一种新型的鳞翅目昆虫细胞表达系统，该系统主要包含3个

8、调节外源蛋白表达序列：Bombyx mori的肌动蛋白基因启动子；Bombyx mori的核型多角体病毒(BmNPV的立早基因ie-1(编码俄IE-1蛋白，该蛋白是种转录激活因子，可在体外激活肌动蛋白基因启动子)；BmNPV勺同源重复序列3(HR3)可作为肌动蛋白基因启动子的增强子。三者协同作用，可使转录活性提高1000倍以上，从而大大地提高外源蛋白的表达水平。另外目前还有一种新型的宿主范围广的杂合核多角体病毒(HyNPVX应用于昆虫细胞表达系统的构建，该病毒 由AcNPVM BniqP 发展而来。一般情况下杆状病毒表达系统所能表达的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分为非分泌性。为了解决这个

9、问题将Hsp70（热休克蛋白70）与外源蛋白共表达可明显提高重组蛋白的分泌水平，这 是因为分泌性多肽被翻译后必须到达内质网进行加工才干被分泌 至胞外。如果到达内质网前，前体多肽就伸展开来，流露出疏水残 基，残基间的相互作用可引起多肽的凝聚，这对最终的表达水平有很大影响。而Hsp70是一种分子伴侣，能够与新翻译的多肽结合， 抑制前体肽的凝聚使前体肽顺利到达内质网进行加工，从而提高蛋白的分泌水平。最近，人们又构建了杆状病毒-S2表达系统，该系统能将重组杆状 病毒转染果蝇S2细胞，以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫 细胞（如sf9、sf21）中复制，不克不及在其他昆虫细胞（如果蝇细胞）中复制，然而

10、目前研究标明在一定条件下，杆状病毒也能感染 果蝇细胞。在果蝇细胞中，杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发 生作用。杆状病毒-S2表达系统的表达载体利用的是果蝇启动子如 Hsp70启动子、肌动蛋白 5c启动子、金属硫蛋白基因启动子等，其中，Hsp70启动子的作用最强。重组杆状病毒感染S2细胞后不会引起宿主细胞的裂解，且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似，因此,杆状病毒-S2系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。昆虫 细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操纵平安，表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域3、哺乳动物细胞表达系统由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰发生的外源蛋白质，

11、在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于 天然蛋白质。哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强 子、选择标识表记标帜基因、终止子和多聚核甘酸信号等。将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过2类方法：一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞，二是通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE 一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞 中。外源基因的体外表达一般采取质粒表达载体，如将重组质粒导入CHC胞可建立高效稳定的表达系统， 而利用COS胞可建立瞬 时表达系统。目前，病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力 工具，在临床基因治疗的探索中也发挥了重要作用。痘苗病毒由于其

12、基因的分子量相当大（约187kb）,利用它作为载体可同时拔出几 种外源基因，从而构建多价疫苗。另外，逆转录病毒感染效率高， 某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因，但要注意的是逆转录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险性。由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采取该类病毒构建的 载体被广泛应用腺病毒载体的构建依赖于腺病毒穿梭质粒和包装 载体之间的同源重组。但是哺乳动物细胞内的这种同源重组效率很 低，利用细菌内同源重组法构建重组体效率会大大提高，即将外源基因拔出到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒，将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希菌另一种方法是通过 病毒包装质粒共转化大肠埃希菌另

13、一种方法是通过 CrelaxP系统构建重组腺病毒载体，在转移质粒和包装质粒中都拔出laxP位点，然后将两个质粒共转染表达 Cre重组酶的哺乳动物细胞，通过 Cre 介导两个laxP位点之间的DNAt生重组，可获得重组腺病毒，这 种重组效率比一般的细胞内同源效率高30倍。最近，人们在杆状病毒中拔出巨细胞病毒的启动子建立了高效的基因转移载体。由于杆状病毒是昆虫病毒，在哺乳动物细胞中不会引起病毒基因的表 达，而且载体的构建容易，因而利用杆状病毒进行基因转移为我们 提供了很好的途径。利用哺乳动物细胞表达外源基因时，大多数情况下不需要诱导， 但当表达产品对细胞有毒性时应采纳诱导，这样可防止表达产品发生早

14、期就对细胞发生影响。哺乳动物细胞中用到的诱导型载体主要与 启动子有关如热休克蛋白启动子可在高温下被诱导，还有重金属、 糖皮质激素诱导的启动子。但这些系统存在一些共同的缺陷，如诱 导表达特异性差；当系统处于关闭状态时表达有泄漏诱导剂自己有 毒性，常对细胞造成损伤等。为此，Gossen等构建了受四环素负调节的 Tet-on基因表达系统， 该系统由调节质粒和反应质粒组成。调节质粒中具有编码转录激活因子(fIA)的序列，在没有四环素或强力毒素存在的情况下tTA可引起下游目的基因表达。随后Gossen等又对tTA的氨基酸序列进行了改造，构建了受四环素正调节的Tet-on基因表达系统，该系统在没有四环素的

15、情况下启动子不被激活，而在加入四环素或强力毒素后目的基因高效表达。 四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性强的优点。外源蛋白的表达会对哺乳动物细胞发生晦气影响，因此利用哺乳动物细胞表达外源基因时，一个主要问题即是外源基因不克不及持久 稳定地表达。Mielke等构建了一种能够在哺乳动物中稳定表达异 二聚体蛋白的载体系统，在这个系统中，编码抗体重链和轻链的 cDNA及喋吟霉素抗性基因被转录成三顺反子mRNA内部的顺反子通过内核糖体进入位点（IREs）介导进行翻译，通过持续选择压力， 无需繁琐的筛选过程，即可获得持久、稳定表达抗体分子的重组体

16、。 哺乳动物细胞表达系统经常使用的宿主细胞有CHO COS BHK SP2/0、NIH3T3等，分歧的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基 化有分歧的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。利用基因工程技术表达外源蛋白。其产量还不高，难以满足大规模的实际应用。通过转基因动物或转基因植物技术可从动物的乳汁或 植物的叶组织中很方便地获得大量较纯的生物活性物质，但目前这项技术还不很成熟，有待进一步研究。4、结语目前已经建立了多种诱导表达系统， 但它们都有其优点和缺乏， 这 就需要我们根据自己的要求选用适当的表达系统。 一般来说，一个 理想的可诱导表达系统需要符合下述几个方面的要求。特异性：该系

17、统不受其他内源因素的影响，仅能被外源的非毒性药物所活化 非干扰性：该系统成分不克不及对细胞通路有干扰。可诱导性：该系统在非活化状态下本底活性最低，而在活化状态下能快速发生高水平的基因表达。诱导剂的生物利用率： 调节分子能快速渗透人各组织，能通过胎盘屏障及血脑屏障。可逆性：诱导剂能快速被各组织清除使该系统很快恢复非活化状O剂量依赖性：该系统的反应与诱导剂的浓度成正比，以便进行定性定量分析。总之，各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞 不完全相同；哺乳动物细胞发生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操纵繁琐。各种表达系统

18、由于翻译后的加工不完全相 同，因而发生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有不同。Van der Geld 等利用分歧的表达系统表达了蛋白激酶（PR30）,并对它们的抗原性进行了比较，结果发现，在哺乳动物细胞中表达的PR3具有与抗PR3抗体结合的所有表位，在昆虫细胞中表达的PR3具有大部分表位，而在甲醇酵母中表达的PR3只具有少数几个表位。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需表达 的蛋白质性质、实验条件、生产成本、表达水平、平安性等，权衡 利弊后再选择相应的表达系统。随着人类基因组计划的完成 ，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因

19、是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对 宿主细胞发生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，因此，组成型表达系统的应用受到一定限制。转基因技术的发展使我们可以在体内更有效地研究基因的功能，由于大部分基因在体内都是在特定 组织或特定发育阶段表达的，要想有效研究这些特定基因的作用，就需要在特定的时间以适当的表达水平实现目的基因的表达。诱导表达系统可以在时空上控制目的基因的表达，这对认识基因在生长发育、生理活动及其病理过程中的作用具有重要意义。较早的诱导表达系统通常采取哺乳动物自己的基因表达调控元件，虽然用诱导剂可以控

20、制目的基因的表达，但由于诱导剂在细胞内还控制其他的靶基因，这可能会严重干扰对目的基因的研究 ，发生假阳性或 假阴性实验结果。为了解决这一问题，一些生物学家利用非哺乳动物的基因表达调控元件或不再对响应内源诱导剂的突变型内源表 达调控元件建立了一些可诱导表达系统。目前比较成熟的诱导表达系统主要有 4种：四环素诱导表达系统，蜕皮激素(ecdysone)诱导 表达系统，他克莫司(tacrolimus,FK506)/ 雷帕霉素(rapamycin)诱 导系统和RU486诱导系统。1、四环素诱导系统四环素诱导系统(tetracycline inducible system)是由 Gossen 及Bujar

21、d首先建立的，该系统采取细菌的四环素抗性把持子，因为它完全是来源于原核细胞，因此有较好的特异性。此系统的作用依赖 于四环素调控的反式作用因子(tTA/rtTA)和反式作用因子依赖的启动子两个成分。四环素反式激活蛋白(tTA)是一个包含大肠杆菌TN10四环素耐药把持子阻遏物和单纯疱疹病毒p16蛋白(VP16)C端部分的融合蛋白，tTA依赖启动子由融合有 RNA聚合酶II启动子的 四环素把持子(tetO)基因序列构成，这种融合使真核细胞中的tet阻遏物成为很强的翻译激活物。在缺乏四环素及其衍生物的条件下tTA与tetO序列结合，使tTA依赖启动子的转录过程被激活；而在 存在四环素及其衍生物的条件下

22、，tTA无法与其靶位点相互作用，转 录也就无法进行;tet系统中tTA的作用称为tet-OFF。后来Gos-sen 等又构建了反式tTA(rtTA),它是一种突变形式的tTA,包含突变形 式的蛋白tetR。与tTA作用相反，这种rt-TA只有在四环素及其衍 生物的作用下才干与 DNA结合并激活转录。如果没有药物刺激，就 不表达目的基因，因此rt-TA的作用称tet-ON。这两种蛋白在组织 培养、果蝇及转基因小鼠中都被证明能有效调控外源基因的表达。Parrado等成功的应用tet-OFF系统证实PLZF(早幼粒细胞白血病 锌指)基因在淋巴细胞中表达具有抗凋亡作用。Rhoades等应用四环素可诱导

23、系统成功建立了转基因小鼠模型，为研究 AML1-ETO在白血病发生中的作用奠定了坚实的基础。四环素诱导系统在细胞水平和转基因动物中被广泛用来研究基因 的功能，但它有一个显著的缺点，即只有筛选大量的克隆或动物才干得到有较低表达布景而目的基因能显著激活的理想克隆或转基 因品系。解决这一问题的一个战略是把此系统的各元件构建到同一个载体上，这样只需一次转染就可以使基因的转录得到调控。逆转 录病毒把基因转移到细胞内的能力比质粒转染有效得多，Bohl等7就通过使用简化的逆转录病毒载体取得了理想的结果。针对rtTA有本底表达的缺陷又发生了几种改进的系统。tTR是一种改进的tetO的抑制物，当它与rtTA共同

24、表达时，若无四环素及其 衍生物就与tetO结合从而抑制rt-TA的本底表达，而在四环素等的 作用下，tTR不克不及与DNA吉合而由rtTA占据tetO位点，因此目 的基因的表达被高效激活。2、蜕皮激素诱导表达系统蜕皮激素诱导表达系统是基于昆虫蜕皮激素通过蜕皮激素受体激活基因表达的能力而设计的。该系统使用蜕皮激素受体与果蝇超螺旋蛋白(ultraspiracleprotein,USP) 的异源二聚体，加入蜕皮激素 或合成的类似物幕黎留酮 A(muristeroneA)后，蜕皮激素与其受体结合，蜕皮激素受体就与 US磔生相互作用，进而与DNA!的反 应元件结合，最终启动下游目的基因的转录。由于哺乳动

25、物细胞对 蜕皮激素(或幕黎爸酮A)没有反应性，也不含蜕皮激素受体，所以本 底转录水平非常低。这种诱导系统在幕黎留酮A作用下可得到100150倍的高表达。后来又发展为一种改进的蜕皮激素系统，这一系统把蜕皮激素受体突变体含依托泊昔(VP16)的反式激活结构 域与USP的哺乳动物类似物-类视黄醇X(RXR)融合在一起。由于蜕皮激素受体的 DNA吉合位点也可以被人类受体（类法尼醇X受 体）识别，上述系统改变了 DNA结合位点的序列，使它只能被突变的 蜕皮激素受体识别，这就防止了内在激素的影响，极大地降低了本底表达，在培养的细胞系中甚至可得到比本底高10000倍的诱导水平。在小鼠腹膜内注射幕黎留酮A16

26、h后，也检测到基因得到相当高水平的表达。幕黎留酮 A没有毒性也没有致畸性，而且和蜕皮激素 一样可在注射后20h以内完全排泄，因此这一系统是进行转基因动 物实验的一个理想工具，在基因治疗方面也很有前景。若在这一系 统上用一个组织特异的启动子代替CMVS动子，就可使目的基因只能在特定的组织或细胞中诱导表达，这对在转基因动物的特定组织中研究靶基因的功能非常有用。Xiao等就用骨骼肌的 -肌动蛋白 启动子代替了 CMV动子，他们用改造的可诱导系统建立稳定细胞 株，研究发现在分化成熟的肌细胞中可诱导报导基因的表达，而在未分化的肌细胞中则没有表达。Stolarov 等13通过蜕皮激素可诱导系统证实PTEN

27、K抑制PI3K通路，从而说明了 PTEN卬制肿瘤的 机制。3、他克莫司（FK506）/雷帕霉素（rapamycin）诱导系统 环抱素A受体和亲免素（FKBP12-rapamycin相关蛋白，FRAP）蛋白家 族以及他克莫司（tacrolimus,FK506）-结合蛋白（FKBPs）都含有化学结合结构域，此结构能与DNA吉合结构域和反式激活结构域相融 合。而免疫抑制剂FK506、雷帕霉素和环抱素A（CsA）等小分子化学 诱导物可以诱导这些嵌合转录因子的二聚化，从而强烈刺激陈述基因的表达。因此在不影响正常细胞生理过程的情况下,就可以通过因的表达。因此在不影响正常细胞生理过程的情况下,就可以通过诱导

28、二聚体的小分子药物的浓度以剂量应答的方式调控靶基因的 表达水平。为了能用于基因治疗，又对这一系统进行了一系列人源化的改进，如转录激活因子的非人源部分用一般认为无免疫性的成分取代,GAL4部分则由嵌合的DNA吉合结构域ZFHDt代,VP16激活结构 域可以用NF-kBp65的激活结构域代替，最后亲环蛋白由FKBP12雷 帕霉素结合结构域（FRB）取代，而不必人源的FKBP12看帕霉素结合 蛋白激酶（FRAP）。FRB-FKBP12的异源二聚体可以被雷帕霉素（比FKCsA更有效）高效诱导，从而形成有功能的完整转录因子 ，最终启 动转录。这一系统在体外和体内实验中布景表达都比较低，而在雷帕霉素的刺激

29、下有高水平的表达。雷帕霉素可以与FRAPa酶2合， 而FRAP可以介导免疫抑制效应，因此雷帕霉素有一定的增殖和免 疫抑制活性，这成为该系统应用的一个潜在限制。这一问题通过选 用雷帕霉素的类似物得到了解决，此类似物与野生型FRAP激酶的结合能力较差，因此不会发生免疫抑制，在体外实验中也发现此类 似物也不抑制细胞的增殖。最近，利用雷帕霉素诱导的人源化系统 （rapamycin-in-duciblehumanizedsystem,RIHS）,通过腺相关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）转染小鼠和非人灵长类动物来表达鼠红细胞生成素，实验标明可以通过控制雷帕霉素的剂量调控体内 转基因的表达。4、RU486诱导系统这一系统采取截短的黄体酮受体的突变体，这种突变体不克不及和黄体酮或其他内源类固醇激素结合，但却能被黄体酮的拮抗剂RU486a活。这种突变的类固醇结合结构域融合到酵母GAL4DN砧合结构域和疱疹病毒 VP16