血管窦内皮细胞改变在肝癌组织缺血再灌注损伤中的作用

1、血管窦内皮细胞改变在肝癌构造缺血再灌注损伤中的作用【摘要】目的研究肝癌构造缺血再灌注后血管窦内皮细胞Sinusidalendthelialells，SE的损伤。要领兔肝脏注射VX2肿瘤构造混悬液，创立肝脏肿瘤和缺血再灌注模子。测定再灌注各时点构造中超氧化物歧化酶SD和一氧化氮N的含量；用HE和荧光脱氧核苷酸末了转移酶介导的dUTP缺口末了标识表记标帜法TUNEL染色不雅察和比力两种构造中SE的凋亡环境。效果缺血再灌注后癌构造中的SD浓度落落明显,于再灌注1h即达最低程度(64.594.97)，厥后渐渐规复但至再灌注7d仍低于再灌注前(121.126.88)。N浓度在肝癌构造和正常肝构造均有落落

2、。肝癌构造缺血再灌注后SE凋亡细胞数目显着增长，至1d时达最高程度54(3.2)。至再灌注7d时阳性细胞仍多于缺血再灌注前33(4.9)，其凋亡细胞数目多于正常肝构造。结论SE的改变在肝癌构造缺血再灌注后的损伤历程中起紧张作用。肝癌构造的改变较正常肝构造更为明显。【关键词】肝肿瘤再灌注损伤凋亡兔0弁言研究创造,肝脏及肝脏肿瘤缺血再灌注后可造成显着的损伤,其重要缘故原由是氧自由基的产生增长和细胞凋亡1,2。研究证实，肝脏肿瘤的生长必需依靠于血管的天生。肝脏肿瘤的消长和自身血管的增殖与凋亡有严密干系3。在相干研究中创造,除氧自由基对肝癌细胞的直接损伤外，缺血再灌注对与肝癌构造生长严密相干的微血管是

3、否造成损伤及对肝癌细胞损伤历程中的作用还不明晰。我们在创立肝脏肿瘤构造缺血再灌注模子的底子上，对肝脏肿瘤构造内氧自由基的改变和血管内皮细胞的凋亡举行了不雅察，为研究肝脏肿瘤构造缺血再灌注损伤的机制和创立肝癌治疗要领打下基矗1质料和要领1.1质料纯种成年新西兰明白兔36只，牝牡不拘，体重2.02.5kg，由第四军医大学实行动物中央提供。1.2模子制备及动物分组动物分为缺血再灌注前比较组即假手术组、缺血再灌注后0in、1h、1d、3d和7d共6个组,每组6只。取VX2瘤株构造块混悬液，超声引导下穿刺肝左中叶，迟钝推注0.5l制作肝癌动物模子。动物以速眠新肌肉内注射麻醉0.15l/kg，开腹后寻出接

4、种肿瘤构造的肝左叶，分散供给有癌构造的肝左叶肝动脉分支，用无损伤血管钳阻断动脉血流60in后，松开血管钳规复动脉血流。按各时间点切取肿瘤构造和正常肝脏构造，部门置70冰箱快速冷冻，部门置结实液结实以备SD和N检测和白腊切片。SD和N试剂盒购自南京建成生物工程研究所。接纳721A型分光光度计。细胞凋亡测试盒购自美国罗氏公司(RheDiagnstisGbH)。1.3检测工程及要领按试剂盒说明书要求制备构造匀浆并测定卵白含量。同样根据N说明书要求设定测定管、空缺管及尺度管，参加相应试剂和待测标本，测定D值按公式盘算N的含量。构造块脱水后白腊包埋，5一连切片,HE染色,光镜下不雅察。长条状细胞核内染色

5、质致密浓缩，核碎裂及细胞质淡赤色等为凋亡细胞。一连不雅察5个切片，盘算凋亡细胞的百分率。根据细胞凋亡测试盒的操纵流程举行：构造切片二甲苯中脱蜡、经梯度酒精水化、PBS缓冲液振洗后，以卵白酶K温育30in37，再用PBS振洗3次后，每次5in。切片滴加50lTUNEL反响液，置湿盒内37孵育60in。PBS振洗3次共15in，伊文蓝衬染后，加卵白甘油液封片，荧光显微镜下不雅察，照相。胞核内出现黄绿色荧光为阳性细胞。取每个高倍镜视野200计数凋亡细胞。除不滴加TUNEL反响液外，用同样要领和步调反响举行阴性比较。构造切片标本上滴加DNA酶以裂解DNA，然后根据TUNEL标识表记标帜步调依次举行阳性

6、比较。1.4统计学处置惩罚2效果2.1SD和N改变及血管窦内皮细胞凋亡正常肝构造和肝癌构造中SD从再灌注0in落落，厥后虽有所上升但至7d仍显着低于再灌注前。N浓度从再灌注0in开始落落，厥后虽有上升但至再灌注7d仍保持较低程度。HE和TUNEL染色表现，再灌注0in肝脏血管窦内皮细胞凋亡细胞开始增多，至再灌注13d保持最高程度,至7d时仍显着高于再灌注前程度。HE和TUNEL染色效果表现肝脏血管窦内皮细胞凋亡纪律同等，见表1、2。2.2肝癌构造和正常肝构造的比力固然肝癌和正常肝构造缺血再灌注后SD和N均有改变，但经统计学阐发，再灌注前、再灌注后各时点的癌构造SD和N浓度及其变革程度显着高于正

7、常肝构造。肝癌构造中血管窦间隙不规矩，HE染色见内皮细胞呈线状或散在漫衍。长条状内皮细胞具有核浓缩，染色质碎裂等特点为凋亡细胞。癌构造中凋亡细胞的数目显着多于正常肝构造，见表1、2。3讨论构造内血管的增殖对肿瘤构造的生长起了紧张的作用。大量研究效果表白，缺血再灌注对正常构造具有显着的损伤作用，但也与肿瘤的产生生长有关，缺血再灌注历程中的氧自由基对肿瘤构造也可产生显着的细胞凋亡和损伤4。我们在研究中已创造，肝癌缺血再灌注后SD和N浓度均出现落落。由于SD是氧自由基的扫除剂，在扫除氧自由基的历程中得以斲丧而使其浓度落落。N也可与增多的氧自由基反响使其浓度低落。SD和N的改变间接反响了氧自由基增多和损伤。氧自由基的改变除造成了肝细胞的损伤和凋亡外。也大概使肝血窦内皮细胞损伤和凋亡。实行效果表白，肝癌缺血再灌注后肝血窦内皮细胞出现了显着的凋亡且数目变革特点与SD及N相似，提示氧自由基的改变与肝血窦内皮细胞凋亡有显着的干系。因此根据肿瘤构造与血管增殖