柳叶洗眼液的制备及猴肾传代细胞中抗EV70病毒的实验研究

1、柳叶洗眼液的制备及猴肾传代细胞中抗EV70病毒的实验研究【关键词】柳叶；,洗眼液；,EV70病毒摘要：目的研究柳叶洗眼液并观察疗效，讨论柳叶洗眼液抗EV70病毒的作用。方法采用水提、醇沉、超滤、灭菌等方法从新颖柳叶制备洗眼液；使用不同浓度的洗眼液对感染EV70的单层培养EK细胞进展处理以观察其抗病毒效应。结果柳叶洗眼液对EK细胞的最大无毒浓度为1/4药浓度。在病毒感染的同时给予柳叶洗眼液可明显抑制病毒的增殖。结论柳叶洗眼液具有明显的抗EV70的作用。关键词：柳叶；洗眼液；EV70病毒PreparatinfillLeavesEyeashingLiquidandExperientalStudyfi

2、tsEffetfAnti-EV70Abstrat：bjetiveTakeakindfillleaveseyeashingliquidandbserveitsantiviruseffet.ethdsEyeashingliquidasadefrfreshillleavesbyaterextratin,extrafiltratinandsterilizatin.BthinfetedbyEV70andnn-infetedsinglelayerfEKellseretreatedbytheeyeashingliquidatdiffferentnentratin.ResultsItshighestharle

3、ssnentratinusedttreattheEKellsas25perentftheriginalliquid.TheEV70prliferatinasbviuslyinhibitedthrughEKelltreatentfeyeashingliquidsiultaneuslyEV70infetin.nlusinillleaveseyeashingliquidisakindfeffetiveantivirusagent.Keyrds：illleaf;Eyeashingliquid;Entervirus70(EV70)流行性出血性结膜炎epidihaerrhaginjuntivitis,EH

4、是由肠病毒70型entervirus70,EV70感染所致的一种传染性极强的眼病，目前此病主要以抗病毒药物治疗，但效果不甚理想，根据民间验方研制了柳叶洗眼液。为了更进一步理解柳叶洗眼液的抗病毒作用，我们选择了对EV70敏感并能产生细胞病变的猴胚肾EK传代细胞作为检测系统，观察该药物的体外抗病毒效果。1材料与方法1.1材料UV265型紫外-可见分光光度计日本岛津；柳叶Salixbabylnia.L.秋天现采现用或采集后低温放置；邻苯二酚优级纯含量99.9%；其它试剂均为分析纯。1.2方法1.2.1柳叶洗眼液的制备1.2.1.1处方柳叶200g，焦亚硫酸钠1g，乙二胺四乙酸二钠0.3g，总量100

5、0l。1.2.1.2制备方法取柳叶200g，用常水洗后，再用蒸馏水洗，置玻璃烧瓶中，加水500l，加热提取1h，滤出液体，药渣再加水500l，提取1h，滤出液体，合并两次滤液。浓缩至500l，加95%乙醇1000l，搅动匀，静置24h，过滤，减压回收乙醇，至无醇味，加蒸馏水950l，焦亚硫酸钠1g，乙二胺四乙酸二钠0.3g，搅匀，用0.1lL-1盐酸调pH67，用0.3滤膜抽滤，最后定容至1000l，灌封于100l玻璃瓶中，100流通蒸汽灭菌30in。1.2.2质量标准1.2.2.1性状本品为淡黄色透明液体。1.2.2.2鉴别取柳叶洗眼液50l，置分液漏斗，参加乙醚50l，萃取3次，弃去水层，

6、合并醚层，水浴回收乙醚，残渣用乙醇定容至5l。另取邻苯二酚制成每2gL-1甲醇溶液，作为对照品。照薄层色谱法试验1，汲取教训上述两种溶液各210l。分别点于同一硅胶G薄层板上，以丙酮-25%氨水991为展开剂，展开，取出，晾干，于碘蒸气中放置1in，在与对照品相应的位置上，供试品色谱分别显一样的红棕色斑点。1.2.2.3含量测定标准曲线的绘制：精细汲取邻苯二酚标准溶液精细称取枯燥至恒重的邻苯二酚10g,加95%乙醇5l溶解，加1lL-1盐酸5l，用水定容至5l0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2l量瓶中，分别参加1lL-1盐酸2.4l，显色剂1l亚硝酸钠10g，钼酸钠15g，加水溶解

7、，定容至100l，1lL-1氢氧化钠5l，用水定容至刻度，放置30in，以水为空白，在波长5001n处测定吸收度。结果说明，邻苯二酚在1.59.0gl-1范围呈良好的线性关系，其回归方程为：A=0.0817+0.0381，Y=0.9996。含量测定：精细汲取柳叶洗眼液50l，置分液漏斗，参加乙醚50l，萃取3次，弃去水层，合并醚层，水浴回收乙醚，残渣用水定容至5l。精取1l，按标准曲线绘制方法测定吸度并计算含量。回收率实验：采用加样回收法，取已测含量的柳叶洗眼液适量，分别添加邻苯二酚，按柳叶的测定计算回收率，平均回收率为96.1%。RSD2.54%。1.2.3抗肠道EV70病毒的实验1.2.3

8、.1细胞单层培养EK传代细胞由军事医学科学院五所微检中心细胞库提供，生长液1640含10%小牛血清，维持液1640含2%小牛血清，在37、5%2培养箱中，细胞培养24h。1.2.3.2病毒EV70毒株名：AH/J670/71购自昆明医学生物所。实验用病毒均为我实验室用EK细胞传代第2代。1.2.3.3病毒感染及TID50/l滴定病毒感染及滴定在2550方瓶中、单层EK细胞上进展，以细胞病变ytpathieffet,PE作为病毒感染指标，每瓶细胞加不同稀释度病毒2l，每个稀释度接种4瓶细胞，室温吸附1.5h后，弃去病毒液，参加维持液，33孵育，逐日观察PE出现情况，滴度按Behrens-Kaer

9、ber方法计算，以TID50/l表示。1.2.3.4柳叶提取液对EK细胞的毒性实验采用柳叶提取原液、柳叶提取原液1/2浓度、柳叶提取原液1/4浓度3种浓度，分别参加到细胞中，在28不同时间，观察对细胞生长的影响。1.2.3.5柳叶提液抗EV70作用为了确定柳叶提取液的抗病毒作用，采用病毒感染细胞的前60in给药，感染细胞90in后给药，病毒与药物同时参加到细胞中等不同的途径给药进展观察，观察细胞出现PE的情况。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1EV70AH/J670/71TID50滴定经实验计算，该毒株LgTID50/l为7.76；图中AD显示EV70在EK单层细胞中繁殖生长，产生PE情况。见

10、图1。a正常细胞对照，bd分别为毒株感染10-524、48、72h细胞出现PE情况图1EV70AH/J670/71在EK单层细胞中繁殖产生PE情况略2.2柳叶提取液对EK细胞的毒性表1显示EK细胞在3种不同浓度柳叶提取液作用下，不同时间的细胞生长情况。结果说明：原浓度在细胞中作用60in内，细胞无明显损伤。当原药浓度在细胞中作用90in，80%以上细胞的生长形态发生不可逆改变，细胞变圆、肿大、折光性增加、最后裂解。柳叶提取液对EK细胞的最大无毒浓度为1/4原药浓度。见图2。a正常对照；b、药物作用30，60in图2柳叶药物原液对EK细胞生长的影响略表1不同浓度药物对EK细胞生长的影响略为无损伤

11、+为无明显损伤+为不可逆改变的损伤2.3柳叶提取液的抗EV70作用实验中我们采用了EV70感染细胞的同时给药，攻击病毒量为100TID50，给药物组细胞出现细胞病变的时间比无药对照组后延4824h，结果说明，在感染的同时用药，显示了对EV70的明显抑制作用，与对照组比拟，用药组出现PE的时间后延当接种病毒量为1000TID50/l时，PE出现延时1224h，PE程度明显减弱，细胞存活率进步，通过活细胞计数发现，当无药对照组100%细胞出现PE时，药物组产生PE的细胞不到30%。见图3。a、b为加药组；、d为无药对照；b、d为a、的4倍放大照片图3药物+EV7010-5在试管内作用于1h后，参加

12、到细胞吸附1.5h后，换维持液33孵育52h时的结果略2.4柳叶病毒作用效果观察固定柳叶提取原液浓度，观察不同浓度病毒抑制作用，结果说明，病毒攻击量低于或等于1000TID50时，在48h时，滴定柳叶提液组的病毒滴度比无柳叶提取液对照组降低了1.51.0个对数单位，同时观察到，病毒稀释度愈高，柳叶液的抑制效果愈强，其细胞PE程度弱，时间后延4824h，活细胞百别离增大。3讨论柳叶主要含有水杨苷、碘、邻苯二酚、鞣质1，2等物质，其生理活性为协同作用，通过实验建立柳叶中邻苯二酚定性、定量的方法，仅作为柳叶或制剂质量标准的一项指标。制止病毒吸附，干扰病毒损害细胞，是寻找抗病毒药物的一种途径4，5。实验结果说明，柳叶提取液对EV70有明显抑制作用3，在阻实验条件下细胞无毒性。在本实验中，当病毒感染细胞的同时加药，表现出较好的抑制效果。当药物浓度不变时，随着病毒感染剂量的减少，药物的抑制作用愈强，细胞病变出现时间明显后延，活细胞百别离增大，这也证实了柳叶提取液直接抗病毒作用。参考文献：1国家药典委员会，中国药典，部S.北京：化学工业出版社，2022：附录VIB.2冉先德.中华药海，上卷.哈尔滨：哈尔滨出版社，1993：56.3陈娟，黄祥瑞.柳叶1号药物抗EV70作用的体外效果观察J.军事医学科