分子光谱基础知识

1、分光光度计的原理 分光光度法测量的理论依据是伯郎比耳定律：当容液中的物质在光的 照射和激发下，产生了对光吸收的效应。但物质对光的吸收是有选择性的，各种不同的物质 都有其各自的吸收光谱。所以根据定律当一束单色光通过一定浓度范围的稀有色溶液时，溶 液对光的吸收程度A与溶液的浓度c （g/1）或液层厚度b（cm）成正比。其定律表达式A=abc荧光分光光度计原理:在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常 有良好的正比关系，即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析，与紫外-可见分光 光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫 光经滤

2、光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被 光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。 物质荧光的产生是由在通常状况下 处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回 基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光三.荧光与分子结构的关系1.分子结构与荧光具有p、p及n、p电子共轭结构的分子能吸 收紫外和可见辐射而发生p -p*或n - p*跃迁，然后在受激分子的去活化过程中发生p*- p 或p*- n跃迁而发射荧光。发生p - p*跃迁分子，其摩尔吸光系数（自）比n - p*跃迁分子 的大1001000倍，它

3、的激发单线态与三线态间的能量差别比 n - p* 的大的多，电子不易 形成自旋反转，体系间跨越几率很小，因此， p - p* 跃迁的分子，发生荧光的量子效率高， 速率常数大，荧光也强。所以一只有那些具有p- p共轭双键的分子才能发射较强的荧光; p电子共轭程度越大，荧光强度就越大（lex与lem长移）大多数含芳香环、杂环的化合物 能发出荧光，且p电子共轭越长，F越大。2.取代基对分子发射荧光的影响（1）（苯环上） 取代给电子基团，使p共轭程度升高a荧光强度增加：如-CH3, -NH2，-OH，-OR等（2） （苯环上）取代吸电子基团，时荧光强度减弱甚至熄灭:如:-COOH，-CHO, -NO2

4、，-N=N-（3）高原子序数原子，增加体系间跨越的发生，使荧光减弱甚至熄灭。女口Br, I。3.共面 性高的刚性多环不饱和结高的分子有利于荧光的发射。例如:荧光素呈平面构型，其结构具 有刚性，它是强荧光物质;而酚酞分子由于不易保持平面结构，故而不是荧光物质。有机化合物的紫外-可见吸收光谱，是其分子中外层价电子（三种：o电子、n电子、n电子） 跃迁的结果。分子轨道理论:一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处 于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基 态向激发态（反键轨道）跃迁。主要有四种跃迁，所需能量（AE）大小顺序为：nn* nn* no

5、* oo* 1. oo*跃迁饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区（吸收波长 九200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到）。如甲烷的九max为125nm,乙烷九max为 135nm2. no*跃迁 含非键电子的饱和烃衍生物（含N、O、S和卤素等杂原子）均呈现no* 跃迁。分子吸收光谱仪 分子中包含有原子和电子,分子,原子,电子都是运动着的物质,都具有能量, 且都是量子化的.在一定的条件下,分子处于一定的运动状态,物质分子内部运动状态有三种 形式:1 电子运动:电子绕原子核作相对运动;2原子运动:分子中原子或原子团在其平衡位置上 作相对振动;3 分子转动;整个分子绕其重心作旋转运动.1.原理：原

6、子吸收光谱法，即基于原 子由基态跃迁到激发态时对辐射光吸收的测量。通过选择一定波长的辐射光源，使之满足某 一原子由基态跃迁到激发态能级的能量要求，则辐射后基态的原子减少，辐射吸收值与基态 原子的数量有关，即由吸收前后辐射光强度的变化可确定待测元素的浓度。荧光光度计工作原理：由光源发出的光，经第一单色器(激发光单色器)后，得到所需要的 激发光波长的光。设其强度为I0,通过试样池后，由于一部分光被荧光物质所吸收，故其 透射强度减为I。荧光物质被激发后，将向四面八方发射荧光，但为了消除入射光及散射光 的影响，荧光的测量应在现激发光呈直角的方向上进行。仪器原第二单色器称为荧光单色器。 其作用是消除溶液

7、是可能共存的其它光线的干扰，以获得所需要的荧光。荧光、磷光与有机化合物结构的关系跃迁类型：大多数荧光物质受激发后：经历：n-n*, mn*，跃迁(激发)。经过振动弛豫或无辐射跃迁发生n*n，n*n跃迁产生荧光。nn* 跃迁的摩尔吸收系数较nn*跃迁大102103倍，nn*跃迁的寿命(107109s)比 nn* (10 5107s)要短。由n*n跃迁常能产生较强的荧光。n*n跃迁产生的荧光 较弱。发生nn*跃迁时，产生系间窜跃，最后从n*三重态返回到n基态，产生更强的磷光。 总之，nn*跃迁是产生荧光的主要跃迁类型化学发光分析的基本原理1、原理：基于化学反应提供足够的能量，使其中一种反应产物的

8、分子的电子被激发，形成激发态分子，当它们从激发态跃迁回到基态时，就发出一定波长的 光。紫外吸收法测蛋白质含量 蛋白质分子中含有酪氨酸,色氨酸及苯丙氨酸残基,它们的结构中 具有共轭双链，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处在此波长附近，蛋白质溶液的 光吸收值与其含量(范围是0.11.0mg/m 1)成正比，因此,280nm的吸光度可用作蛋白质的定量 测定.但不同种的蛋白质对280nm波长的光吸收强度因芳香性氨基酸残基含量的不同而有差 异，因此需用同种蛋白质作对照 ，结果才可靠.在半定量测定和纯蛋白的定量测定时 ，可用 280nm 的光吸收法. 此外，部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸，

9、核苷酸和碱基等物质在紫外 区也有强的光吸收， 常与蛋白质类相互干扰.但二者的紫外吸收特性 不一样，由于核酸类物 质在260nm有最大吸收 值,因此,可利用蛋白质280nm和260nm的吸收差法来测定计算蛋白 质浓度. 紫外吸收法操作简便快捷，不消耗样品，低浓 度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的 生化制备及其它研究中应用广泛，尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测.蛋白质的内源荧光 含有芳香族氨基酸 ( 色氨酸 ( t rptop han ， Trp ) 、 酪氨酸 ( tyrosine ， Tyr ) 和 苯丙氨酸 ( pheny1a1anine ， Phe) ) 残基的蛋白质在 280 nm 或 295 nm 的激发光的 激发下会产生荧光 ， 这种荧光称为内源性荧光 ( 天然荧光 ) 。蛋白质荧光来自于 Trp 、 以及 Phe , 其 Tyr 荧光光谱对环境极为敏感, 成为研究蛋白质的结构、折叠动力学以及蛋 白质分子间相互作用的一种理想选择。Trp、和Phe由于其侧链生色基团的不同Tyr而有 不同的荧光光谱 。其荧光峰位波长分别是 348 、 303 、 nm , 其中 Trp 的荧光强度最大 , 而 Phe 的 282 荧光强度则很低 , 因此蛋白质的内源