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文档简介

1、实验八硝酸还原酶活性测定一、目的硝酸还原酶是植物氮素代谢中的关键酶之一，它与作物吸收利用氮肥有关， 对作物的产量和品质有影响。因而可以把硝酸还原酶的活力当作植物营养或农田 施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可初步掌握测定硝 酸还原酶活性的原理与方法。二、原理硝酸还原酶能将NO3-还原成NO2-NO, + NADH + 小卫里%& + NAD, + 哄产生的no2-的量与硝酸还原酶的活性相关。通过测定反应液中产生的no2- 含量，即可确定酶活性大小。NO2-含量可用磺胺显色法测定。NO2-与磺胺及a-萘胺在酸性条件下生成红 色偶氮化合物其反应如下：酶活性可用单位鲜重组织在单位

2、时间内产生的亚硝酸量来表示: 亚硝酸态氮微克数/克鲜重组织1小时。三、实验材料、仪器和试剂实验材料 植物的根、茎、叶，本实验选用白萝卜叶片仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）真空泵和真空干燥器（4）恒温水浴锅（5）恒温箱（6）刻度吸管（lml、2ml、5ml）（7）试管 （8）天平 （9）三角瓶（50ml）3 .试剂（1）亚硝酸钠标准液：称取0.1000g亚硝酸钠（AR），用蒸馏水溶解并定容 至100ml。然后吸取5ml再用蒸馏水定客至1000m1。即为浓度5p g / ml的亚硝 酸钠标准液。0.lmol - L-ipH7.5 磷酸缓冲液0.2 mol - L-1的硝酸钾溶液1 %对氨基苯

3、磺磷酸2%a 萘胺30%三氯乙酸四、操作步骤标准曲线的制作取6支试管，编号，按下表操作操作项目管号123456NaNO2淀标准液(ml)00.40.81.21.62.0蒸馏水(ml)2.01.61.20.80.40NaNO2含量（p g）0246810磺胺(ml)各4a 萘胺各4摇匀在30C水浴中保温20分钟。然后在520ml波长下比色测定消光值。以亚硝酸钠含量为横坐标，消光值为纵坐标绘制标准曲线。酶反应和酶活性测定将白萝卜叶片洗静，剪成0.5cm2h的小片，混匀后称三份，每份0.5 1.0g, 分另放人50ml的三角瓶中，编号按下表加试剂摇匀，置真空于燥器中，抽气10分钟。然后将三角瓶放人恒温箱，在30C暗条件 下保温30分钟。取出后向2, 3号瓶中分别加人l ml 30%三氯乙酸终止反应，将 反应液离心(3000rmp 10分钟)或过滤。分另吸取2ml反应液于三只试管中各加4ml 1%磺胺和0.2 % a萘胺。摇匀在30C水浴中保温20分钟。然后在520ml波长下比色测定消光值。五、结果与计算酶活性(亚硝酸钠p g / g鲜重 h)=亚硝酸钠微克数(|J g)X稀 释倍数/样品重(g)X时间(h)六、注意事项酶促反应在暗条件下进行，以防光照下叶绿体

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